利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶Ⅰ的方法。本发明专利技术的再生氧化型辅酶Ⅰ的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶Ⅰ为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶Ⅰ转化为氧化型辅酶Ⅰ。所述缓冲溶液的ｐＨ为４．０－９．０。所述缓冲溶液中所述还原型辅酶Ⅰ的浓度为０．０２ｍＭ－１０ｍＭ。本发明专利技术的再生氧化型辅酶Ⅰ的方法可将ＮＡＤＨ转化为ＮＡＤ↑［＋］，转化率达到７２％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。
技术介绍
在氧化还原酶中，大约80。/o的氧化还原酶需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+， NADH)作为辅酶，10。/o的氧化还原酶以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+, NADPH) 为辅酶，只有很少一部分以黄素(FMN， FAD)和辅酶Q(PQQ)为辅酶。使用氧化还原酶 进行生物催化时，合成产物的同时会消耗一定量的辅酶。辅酶的高效供应是开发氧 化还原酶催化反应的关键技术之一。辅酶价格昂贵，每摩尔氧化型辅酶I (NAD+)的 价格约为1300欧元，PQQ的价格则超过了 2700000欧元每摩尔，而且辅酶稳定性低， 从技术经济角度考虑，投加大量的辅酶是不可行的。根据生物催化反应的过程经济 性和工业可行性，氧化还原酶在应用中除了必须有合适的酶和反应工程技术以外， 还必须提供高效、低成本的辅酶再生系统。利用辅酶再生系统，不仅能够降低成本，而且可以通过与合适的辅酶再生反应 相耦合，使原本热力学上不易进行的反应变得容易发生。辅酶再生主要有化学法， 电化学法，光化学法，酶耦联法和整细胞生物转化再生辅酶。酶耦联法是利用两个 平行的氧化还原反应酶系统， 一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再生。 为了达到最佳效果,两个酶的底物应相对独立，以避免两个底物竞争同一酶的活性 中心。酶耦联法再生效率高，但由于需要外加酶和对应的底物，再生系统较复杂， 过程控制难。辅酶再生系统中的酶可以是游离状态的，也可以是整细胞。用游离酶 作为生物催化剂有如下的优点只使用一两种酶，能够避免副反应，从而使还原反 应具有对映选择性，同时下游的工艺过程也可以被简化，和整细胞催化相比，可以忽略扩散的限制。但是，使用游离酶时需要添加辅酶，且游离状态的酶对高浓度的 底物和有机溶剂敏感。整细胞催化具有如下的优点酶处在它们的自然环境当中， 更稳定，在发酵过程当中细胞具有内部的辅酶再生系统，仅添加葡萄糖就足以推动 反应的进行。酶法再生NAD+—般常用酶为谷氨酸盐脱氢酶、乳酸脱氢酶、酵母酒精脱氢酶或 者NADH氧化酶。其中，NADH氧化酶由于只需要氧气参与，且产物为水，没有其他副产物的生成，因此是极具潜力的NAD+再生体系之一。在实际应用中，依赖NAD+的R型 特异乙醇脱氢酶(R-specificADH)可以在R，S-l-苯基乙醇中让R型对映体完全氧化， 从而生产纯的S对映体，NADH氧化酶与此反应过程耦合，为ADH提供再生NAD。目前 采用该酶再生的转化数TTN (每摩尔辅酶用于转化生成目的产物的摩尔数)一般可以 达到100到60之间。但是采用纯酶进行再生成本高，酶活性不稳定，特别是对于NADH 氧化酶目前纯化成本还相当高，而且能用的酶的种类非常有限。相对而言，采用整 细胞催化再生辅酶的操作简便，反应稳定，成本低。但是由于NADH为带电分子，且 分子量较大(709.4Da)，通常很难进入细胞进行反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。 本专利技术所提供的再生氧化型辅酶I的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶I (NADH)为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶I转化为氧化型辅酶I (NAD+)。其中，所述缓冲溶液可以为各种缓冲溶液，如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES 缓冲液或三乙醇胺缓冲液等，只要能保证反应在适合的pH范围内进行的缓冲溶液 均可。所述缓冲溶液的pH具体为4. 0-9. 0。所述缓冲溶液中所述还原型辅酶I的浓 度为0. 02函-10mM。所述方法中，反应温度为4-5(TC，在该温度范围内，产气肠杆 菌NADH氧化酶都具有活性，所述温度优选为37°C。所述产气肠杆菌可以是死菌体， 也可以是活菌体，只要产气肠杆菌中的NADH氧化酶存在并具有活性，就可将还原 型辅酶I转化为氧化型辅酶I。产气肠杆菌^^ero力a"er aeiY^朋e^的NADH氧化酶位于细胞外膜，带电荷 的大分子NADH不需要进入细胞进行反应，有利于酶与底物的接触，提高酶的转化 效率。本专利技术利用产气肠杆菌整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法可将NADH转 化为NAD+，转化率达到72%。本专利技术利用产气肠杆菌整细胞生物转化再生氧化型辅 酶I的方法与ADH酶耦联可将乙醇转化为乙醛，转化数为580;与展示手性ADH脱氢 酶的大肠杆菌整细胞耦联可将苯乙醇转化为苯乙酮，与展示手性ADH脱氢酶的大肠 杆菌单独将苯乙醇转化为苯乙酮相比，苯乙酮的产量从O. 12 mM提高到0.65 mM。 附图说明图1为￡ ae/Y^e/ es整细胞再生NAD+转化乙醇为乙醛时不同NADH添加量下乙 醛生产随时间变化曲线。 具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、产气肠杆菌(^>7Z^_ratecz^r aero《e/7e^将NADH转化为NAD+1) 培养产气肠杆菌产气肠杆菌^^ero/^cter朋iY^e/2^; IAM1183接入培养基中(葡萄糖15 g/L、 蛋白胨5 g/L、 K2HP04 14 g/L、 KH2P04 6 g/L、 (NH4)2S04 2 g/L、 MgS04 7H20 0. 2 g/L)， 37 °C， 170 rpm空气浴摇床培养。取60ml经过12小时好氧摇瓶培养的产气肠杆菌IAM1183， 10， 200Xg， 4°(3离 心5min，收集产气肠杆菌菌体。2) NADH转化为NAD+用pH6. 80的50函三乙醇胺缓冲液(TEA)洗涤步骤1)的产气肠杆菌菌体三次， 然后重悬于pH 6. 80的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)中，调整细胞浓度至ODe。。为0. 8， 加入NADH，使NADH的终浓度为210pM， 37°C， 170 rpm培养，作为实验组。用pH6. 80的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)洗涤步骤1)的产气肠杆菌菌体三次， 然后重悬于pH 6. 80的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)中，调整细胞浓度至OD,为0. 8， 加入NAD+，使NAD+的终浓度为210|iM， 37°C， 170 rpm培养，作为对照1。用pH 6. 80的50rnM三乙醇胺缓冲液(TEA)加入NADH，使NADH的终浓度为210|oM， 37°C， 170 rpm培养，作为对照2。用pH 6. 80的50raM三乙醇胺缓冲液(TEA)加入NAD+，使NAD+的终浓度为210pM， 37°C, 170 rpm培养，作为对照3。3) NADH转化为NAD+的效率培养8小时后，测定培养液中的NADH和NAD+的浓度。 NADH和NAD+浓度的测定方法如下1) 样品预处理分别取出5ral培养8小时的培养液，立即置于冰上。加入适量的HC1(6M)分钟， 最后用KOH(IO M)中和pH至6.5-7，加入KOH时要不断震荡样品以避免局部pH过 高，制得测定NAD+的预处理样品。分别取出5ml培养8小时的培养液，立即置于冰上。用适量KOH(IO M)调pH 至12.5，然后在25° C下培养10分钟，制得测定NADH的预处理样品。2) 检测由于在350nm附近紫外激发光激发下NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种再生氧化型辅酶Ⅰ的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶Ⅰ为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶Ⅰ转化为氧化型辅酶Ⅰ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢新会，张翀，吴希，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]