一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达水平的技术方案。该方法中，首先将菊粉酶基因的启动子、α－信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；然后将上述序列插入克鲁维酵母表达载体；最后转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即得。本发明专利技术的方法可以促进克鲁维酵母表达重组蛋白的产量显著增长。本发明专利技术可用于提高多种蛋白的表达量，为降低生产成本、扩大生产规模提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高重组蛋白表达水平的技 术方案。
技术介绍
酵母是一类单细胞的低等真核生物，兼有原核和真核细胞的特点既培养 方便，繁殖快，成本低，易于基因操作，又具有分泌途径，可对真核基因产物进 行翻译后加工修饰，得到正确折叠、有活性的蛋白质。因此酵母表达系统被誉为 最有商业价值的表达系统(F. R. Schmidt, Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry, Appl Microbiol Biotechnol ，65:363—372， 2004)。除应用广 泛的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾卩巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统外，还存在一类以克鲁维酵母(Kluyveromyces)为代表的非常规酵母 表达系统。克鲁维酵母主要包括乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维 酵母(Kluyveromyces fragilis )、马禾斗斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus) 等种类，其中乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为唯一炭源生长的酵母，具有 营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25°C-46°C)、 分泌蛋白能力强，对人类安全(GRAS， Generally Regarded as Safe)等特点，是 一种较理想的重组蛋白表达宿主细胞，迄今已建立了适于外源基因表达的较完善 的乳酸克鲁维酵母表达系统，利用该系统人们己成功表达了人血清白蛋白、a-半乳糖苷酶、牛凝乳酶等多种重组蛋白(Albert J丄van Ooyen et al， Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis, FEMS Yeast Res 6: 381—392, 2006)。酿酒酵母HAP1基因(ScHAPl)编码一种转录因子，调控一些细胞呼吸代谢途径必需基因的转录表达(Pfeifer， K.， Kim, K.S.， Kogan， S. and Guarente, L. 1989. Functional dissection and sequence of yeast HAPI activator. Cell. 56: 291-301)。作为ScHAPl同源基因，乳酸克鲁维酵母HAP1基因(K1HAP1)的功 能目前尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达水平的新方法。本专利技术提供了，该方法包括如下步骤(1) 将菊粉酶基因的启动子、a-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止 子编码序列依次连接；(菊粉酶基因的启动子和终止子序列见GenBank登入号 AF178979; a-信号肽的GenBank登入号J01340)(2) 将(1)得到的序列插入克鲁维酵母表达载体pUKD-S或者pUKD;(3) 用(2)获得的重组载体转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即可。本专利技术中，(3)中采用的克鲁维酵母可以是乳酸克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁 维酵母、马科斯克鲁维酵母或者脆壁克鲁维酵母。本专利技术中，所用的乳酸克鲁维酵母可以是MW179-1DHAP1基因缺陷菌株。 乳酸克鲁维菌株MW179-1D信息见文献Imrichova D et al. K4W-mediated AWQ7 expression in A7^yverowycej /fl"/s, FEMS Yeast Research, 5 (4-5): 323-329， 2005。本专利技术中，(1)中启动子可以是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179 (出处见 Zhang J et al. Cloning of the 尺cf/Z ^ Gene and Development of a Transformation System for A7t(yveromyces "'cm'spo阳s ， Appl Microbiol Biotechnol.， 62(4):387-391,. 2003.)的总DNA为模板，以PI和P2为引物，PCR 扩增获得的；PI的序列如SEQIDN0 2所示，P2的序列如SEQ ID NO 3所示。本专利技术中，(1)中终止子可以是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA 为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增获得的；P5的序列如SEQIDN0 6所示，P6的序列如SEQ ID NO 7所示。本专利技术中，(1)中的目的蛋白可以是酶、细胞因子、多肽、抗体或者疫苗 抗原。本专利技术中的重组蛋白可以是商业上有用的蛋白质，包括酶、细胞因子、多 肽、抗体、疫苗抗原，编码该蛋白质的基因可以来自微生物、植物、动物或人。本专利技术的一个实施例中，(1)中的目的蛋白可以是菊粉酶。本专利技术中，a-信号肽和菊粉酶编码序列通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的 总DNA为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增获得的；P3的序列如SEQ ID N04 所示，P4的序列如SEQ ID NO 5所示。菊粉酶(inulinase)是一类水解卩-2,l-D-多聚果糖果糖糖苷键的一类水解酶。 菊粉酶根据其酶切多聚果糖糖链的方式分为外切酶(EC3.2丄80)和内切酶 (EC3,2丄7)。产生菊粉酶的微生物主要为真菌。鹰嘴豆克鲁维酵母菊粉酶基因 GenBank登入号为AF178979，启动子和终止子序列包括在内。菊粉酶在以下方面 有重要的应用前景。第一是高果糖浆的制备。高果糖浆是理想的天然甜味剂，果 糖的甜度比蔗糖高出80%;能适合糖尿病人食用。同时还具有营养保健功能，能 调节肠胃、提高免疫力、排毒养颜、降解血糖和抗癌等优越的生理学活性，被称 为第三代功能食品。第二方面，是生物能源领域的应用。目前，生物乙醇的生产 主要是以玉米淀粉为原料，原料的种植面临与人用粮食争夺土地的尴尬。菊芋的 主要成分菊粉，它的生长条件粗狂，种植不占用耕地，不仅能生长盐碱地，还能 生长在沙漠地区，能防止土地沙化，以菊粉为原料生产生物乙醇可以成为目前淀 粉乙醇的补充和后备方法。菊粉在菊粉酶的作用下，水解成单糖，能直接被酵母 利用，产生乙醇。因此，制备菊粉乙醇是否可行关键是成本的高低，这其中生产 菊粉酶成本是关键中的关键。本专利技术的方法具体说明如下1.菊粉酶基因启动子、终止子控制的重组蛋白克鲁维酵母表达质粒构建。 (1)重组蛋白基因表达盒构建以克鲁维酵母基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术分别扩 增外切菊粉酶基因启动子和终止子序列，再通过PCR扩增重组蛋白基因序列，将 菊粉酶基因启动子、终止子和重组蛋白基因序列分别进行限制性内切酶酶切处理，经过DNA连接酶的连接反应，将菊粉酶基因启动子、重组蛋白基因和菊粉 酶基因终止子序列依次克隆于pBS—SK质粒上，获得由菊粉酶基因启动子、重组 蛋白基因和菊粉酶基因终止子序列三种元件构成的重组蛋白基因表达盒。采用的 PCR、酶切、连接、大肠杆菌转化等基因工程技术方法均为常规方法，参照《分 子克隆实验指南》(J.Sambrook,etal.,第二版，1996)。 (本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：　（１）将菊粉酶基因的启动子、α－信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；　（２）将（１）得到的序列插入克鲁维酵母表达载体ｐＵＫＤ－Ｓ或者ｐＵＫＤ；　（３）用（２）获得的重组载体转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建平，李育阳，俞静，袁汉英，蔡显鹏，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]