一种利用解脂亚罗酵母菌脂肪酶分两步催化油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油技术

本发明专利技术提供了一种利用解脂亚罗酵母菌ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２７０７的粗脂肪酶酶液及其固定化脂肪酶分别催化废弃动、植物油脂水解、酯化反应，合成生物柴油方法；并提供了该脂肪酶粗酶液和固定化酶的制备方法。该方法中油脂水解和酯化反应均使用脂肪酶为催化剂，不使用强酸强碱，具有反应条件温和、污染小的优点，整个脂肪酸甲酯／乙酯生产过程中不使用有机溶剂，反应安全、效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种利用解脂亚罗酵母菌脂肪酶分两步催化 油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油
本专利技术属于生物化工
更具体地，本专利技术涉及一种使用生物 酶催化油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油。
技术介绍
生物柴油的燃烧性能可以与石化柴油相媲美，是一种新型无污染的可 再生能源，其研究和应用受到了广泛的关注。目前生产生物柴油的方法主要是化学法，化学法使用高温高压、反应 能耗高、副反应多、原料要求严格。研究使用生物酶法合成生物柴油的绿 色化工方法正在成为生物柴油行业的热点。酶法合成生物柴油普遍具有反 应条件温和、副反应少、反应中无污染物排放等许多优点CN1557913A公开了 一种在有机介质反应体系中利用脂肪酶转化油脂 生产生物柴油的新方法，该方法是以短链醇ROH作为反应酰基受体，使用 一些对酶活性没有负面影响的相对亲水的有机溶剂作为反应介质，所述的 溶剂例如是叔丁醇、1,4-二氧六环等，这种有机溶剂的加入量是油脂体积的 20%-200%,利用生物酶催化油脂原料进行转酯反应，合成生物柴油。CN145667々A公开了 一种利用其自制固定化脂肪酶在有机相中催化脂 肪酸和醇的酯化反应。该方法中所用的有机溶剂为沸程40-15(TC的石油馏 出物。酶催化合成生物柴油中使用的固定化脂肪酶大都采用NOV0435。北京 化工大学谭天伟等专利技术了我国自主知识产权的脂肪酶及其固定化方法。他 利用纺织物为载体制成固定脂肪酶，并且利用该固定化酶生产生物柴油的 中试装置已通过专家鉴定。上述酶法合成生物柴油方法将甲醇与油脂等摩尔比混和后，使用固定 化脂肪酶催化转酯反应得到粗生物柴油。此反应体系中产生甘油、水和脂肪酸曱酯。甘油会黏附在固定化酶颗粒上，减少了酶与底物油脂的接触机 会，降低了反应速率，并且该体系中使用甲醇浓度也对固定脂肪酶产生不 可逆的毒害。酶催化生物柴油合成反应由于甘油屏蔽与曱醇毒害两方面原 因，使得该酯交换反应转化率低清华大学刘德华等的研究结果表明，叔丁醇亲水性强于正己烷(CN1884440 "以叔丁醇作为新型有机介质反应体系可以促进曱醇等短链 醇在油脂中溶解，有效降低短链醇对微生物细胞反应活性的负面影响")， 能加大甘油和水的溶解性能。因此使用叔丁醇作溶剂，可以减少甘油对酶 的屏蔽作用。为了减少曱醇对固定化脂肪酶的毒害，刘德华等采用对脂肪 酶无毒害作用的曱酸曱酯替代曱醇，利用曱酸曱酯和油脂发生酯交换反应， 增强酶的稳定性，延长酶的寿命。而且该酯交换反应不产生甘油，不会在 固定化酶表面产生甘油屏蔽。虽然专利CN1884440解决了甘油对固定化脂肪酶的空间屏蔽问题，但 和已有的生物酶催化的转酯反应体系相似，均使用有机溶剂做为底物或产 物的溶解介质。有机溶剂良好的溶解性能增加醇与动植物油脂的混合度， 利于反应底物在固定化脂肪酶表面发生界面反应，催化合成脂肪酸酯。然 而，反应体系中使用的有机溶剂沸程很低(如石油醚、叔丁醇，沸程介于 40-90°C)，易燃易爆，增加了工业化生产的危险性，增加设备的投入强度， 同时由于使用大量溶剂，其生产效率受到影响。本专利技术提供解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707的粗脂肪酶酶液与固定 化脂肪酶的制备方法，解决了反应过程中的关键问题即反应的催化剂脂肪 酶的生产。并提供了利用上述脂肪酶分两步催化油脂合成生物柴油的方法。 第一步利用粗脂肪酶酶液将油脂水解成脂肪酸，此过程中产生甘油水溶 液，与脂肪酸易分离。第二步利用第一步得到的粗脂肪酸与等摩尔的曱 醇或乙醇反应，使用固定化脂肪酶作催化剂，得到粗脂肪酸甲酯(粗生物 柴油)，粗曱酯经蒸馏后即得生物柴油。第二步反应为酶催化脂肪酸和醇的 酯化反应，反应过程中不产生甘油，不存在甘油对固定化酶的屏蔽作用， 相对提高了酵的使用寿命，筒化了产物分离；同时脂肪酸可以与醇以任意 比例混溶，不需要使用有机溶剂助溶，提高了生产效率，极大的增加了安全性，降低了设备投入与生产成本。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是利用解脂亚罗酵母菌(7amw/" /*o/,'ca)CGMCC No.2707脂肪酶的两步合成生物柴油的方法。本专利技术的另 一个目的是常用所述方法得到的柴油。 本专利技术公开了 一种使用解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707(见中国专利技术 专利申请200810172116.8，申请日2008年11月11日)脂肪酶的两步合成 生物柴油的方法，即第一步，使用脂肪酶发酵液将油脂水解成脂肪酸；第 二步，用固定化脂肪酶催化脂肪酸和曱醇或乙醇合成生物柴油。 其中第 一步水解油脂反应原理如下<formula>formula see original document page 6</formula>第二步合成脂肪酸曱酯或乙酯反应原理如下固定化脂肪酶R'COOH + R-OH - R'COOR + H20 (R=_CH3或-CH2CH3) 具体地，本专利技术是按照下述方案实现的。(1)所述脂肪酶制备方法如下粗脂肪酶酶液的制备按照申请号200810172116.8、专利技术名称《一抹 高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变抹、培养方法及其酶应用》的中国专利技术专 利申请所描述的方法制备，本申请将CN 200810172116.8专利技术专利申请全 文加以引用。将^^A罗脊孝霧CGMCC No.2707菌株在茄子瓶斜面培养 l2—24小时后接种于发酵罐培养，培养80—100小时后，测得水解酶活达 到8000u/ml以上时下罐。收集下罐后发酵液，通过转速1900转/分的三足 离心机除去发酵液中固形物与菌体细胞，即得到粗脂肪酶酶液。固定化脂肪酶的制备按所述粗脂肪酶酶液总重量的1%。一5%。把固定化助剂加入到该粗脂肪酶酶液中，再按照载体与所述粗脂肪酶酶液的体积比1: 1-1.5,让其载体与前面得到的粗脂肪酶酶液混合，使得每克载体的 上酶量达到8000U-13000U,然后在温度50。C下进行干燥，使得有酶载体 的水分达到4-8重量％，即得到固定化脂肪酶。固定化脂肪酶可在4。C水箱 内保存有效期不低于3个月。(2) 油脂水解步骤首先往反应器中加入油脂，然后按照每克油脂为 50-100单位加入前面制备的y^腐义罗,孕^"CGMCC No.2707粗脂肪酶酶 液，在所述油脂与水的重量比1: 0.2-1: 1.2、每克油0.05-0.2g十二烷基磺 酸钠或硬脂酸钠为乳化剂，水相pH 5.5-7.0、温度20-55。C与100-300转/分 振荡的条件下进行水解反应12-36小时。当所述油脂的水解率达到90%以 上时，该反应液用2-4N酸进行酸化，使得水相pH为3.5-5.5,再用温度60-80 'C的水洗涤，静置分层，得到含有6.1-8.3重量％甘油的水相与含少量水的 粗脂肪酸相，将粗脂肪酸脱水得到用于酯化步骤的脂肪酸。该步骤得到的 甘油水相可进一步提纯分离，制备高纯度工业甘油或药用甘油。优选地，油脂水解步骤是在脂肪酶催化油脂水解的具体步骤参见申请 号200810110995.1、专利技术名称 一种利用脂肪酶水解油脂生产脂肪酸的 方法的中国专利技术专利申请，本申请将该专利技术专利申请全文加以引用。(3) 酯化步骤将步骤(2)得到的粗脂肪酸与曱醇或乙醇按照摩尔比1: 1-1: 1.5进行混合，然后按照每克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用解脂亚罗酵母菌（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＷ１脂肪酶分两步催化油脂生产生物柴油的方法，其特征在于该方法步骤如下：　（１）所述脂肪酶制备：　粗脂肪酶酶液的制备：　将解脂亚罗酵母菌ＬＷ１菌株在茄子瓶斜 面培养１２－２４小时后接种于发酵罐培养，培养８０－１００小时后，测得水解酶活达到８０００ｕ／ｍｌ以上时，其发酵液通过离心分离除去该发酵液中固形物与菌体细胞，得到粗脂肪酶酶液；　固定化脂肪酶的制备：按粗脂肪酶酶液总重量的１‰－５‰把固定 化助剂加入到粗脂肪酶酶液中，再按照载体与粗脂肪酶酶液的体积比１∶１－１．５，让其载体与前面得到的粗脂肪酶酶液混合，使得每克载体的上酶量达到８０００Ｕ－１３０００Ｕ，然后在温度５０℃下进行干燥，使得有酶载体的水分达到４－８重量％，即得到固定化脂肪酶；　（２）油脂水解步骤：首先往反应器中加入油脂，然后按照每克油脂为５０－１００单位加入前面制备的解脂亚罗酵母菌ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２７０７粗脂肪酶酶液，在所述油脂与水的重量比１∶０．２－１∶１．２、每克油０．０５－０．２ｇ十二烷 基磺酸钠或硬脂酸钠为乳化剂，水相ｐＨ５．５－７．０、温度２０－５５℃与１００－３００转／分振荡的条件下进行水解反应１２－３６小时；当所述油脂的水解率达到９０％以上时，该反应液用２－４Ｎ酸进行酸化，使得水相ｐＨ为３．５－５．５，再用温度６０－８０℃的水洗涤，静置分层，得到含有６．１－８．３重量％甘油的水相与含少量水的粗脂肪酸相，将粗脂肪酸脱水得到用于酯化步骤的脂肪酸；得到的甘油水相进一步提纯分离，制备高纯度工业甘油或药用甘油；　（３）酯化步骤：将步骤（２）得到的粗脂肪酸与 甲醇或乙醇按照摩尔比１∶１－１∶１．５进行混合，然后按照每克脂肪酸重量的１０％加入步骤（１）得到的固定化脂肪酶，在３０℃下振荡或搅拌进行酯化反应３－２４小时，得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，经气相色谱检测得脂肪酸甲酯或乙酯转化率达到９０％；再将得到粗脂肪酸甲酯或乙酯在真空度９３－９８ＫＰａ下进行减压蒸馏，收集１９０－２２０℃馏分为精脂肪酸甲酯或乙酯生物柴油。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟永宏，徐志文，李月娟，周志奇，梁晓梅，杨娜，陈晋南，
申请(专利权)人：秦皇岛领先科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]