本发明专利技术属于农业微生物学技术领域，同时涉及生物化学与分子生物学领域。分离得到一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＨ１，保藏在中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ），保藏编号为ＣＣＴＣＣ：Ｍ２０８１２７。从该解淀粉芽胞杆菌菌株ＣＨ１的培养物中获得具有生物活性物质，被表征为促真菌凋亡脂肽。该脂肽的分子量为１０６５或它的同系物。具有如说明书附图６所示的红外图谱。该脂肽由９碳烷基和８个氨基酸组成，在第７个烷基碳与最后一个氨基酸通过一个氧原子形成环肽。对该解淀粉芽胞杆菌菌株以及其制备的脂肽在细胞凋亡中的生物学应用前景进行了试验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物学
，具体涉及一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的分离筛选及 活性物质的制备。本专利技术还涉及部分生物化学与分子生物学
技术介绍
许多芽胞杆菌，例如枯草芽胞杆菌(5"c,7附^to'fo),蕈状芽胞杆菌(5.W_yc0/&5)和解淀粉芽胞杆 菌(及a/ y/0/!々"e/ac/em)，都可以抑制许多植物病原真菌和人类病原真菌的生长。许多这类抗真菌物质都 被鉴定出具有环状脂肽表面活性剂的特征。这些脂肽能抑制很多真菌的生长，包括曲霉属G^pe/"g说^)， 镰孢菌属(Fm^7',)，丝核菌属(灿/加加"/a)和一些酵母(假丝酵母属)等。还有一些脂肽的抗肿瘤活 性也得到了关注。现在有许多研究者对芽孢杆菌产生的脂肽产生了浓厚的兴趣，关注的内容主要包括它很 高的表面活性和潜在的疗效方面的特性。芽胞杆菌产生的环状脂肽主要包括一个脂肪酸链连接的多肽形成一个环，所以脂肽是一个生物学上的 表面活性剂，它包括-个亲脂和一个亲水基团。基于脂肽是-个高生物表面活性剂，被认为它能通过与细 胞膜的相互作用而使其破裂。还有人认为它们能在双层膜中形成选择性离子通道，包括在磷脂双分子层中 形成选择性离子通道。有关脂肽的作用机理如上所述，基于其表面活性剂的作用导致细胞质膜的穿孔而起杀菌作用。然而， 我们在对由一株解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽作用机理进行研究的时候发现，诱导真菌细胞凋亡也是其抑菌 的重要机理之一。凋亡，又称细胞程序性死亡，首先在动物中发现。最近的研究成果表明，真菌(包括酵 母和丝状真菌)在某些条件下(如衰老、UV、某些化学物质)也可诱导凋亡的发生，从而表现为典型的 凋亡现象，如核浓縮，DNA的断裂，细胞质膜磷脂酰丝氨酸的外翻，活性氧的产生，凋亡小泡的形成等 等一些动物中出现的凋亡特征。在动物细胞中，凋亡通常有2条途径， 一条是通过胞外信号激活细胞内的 凋亡酶caspase，另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的 重要蛋白降解，引起细胞凋亡。我们的实验结果表明，在解淀粉芽胞杆菌脂肽作用后，表现为核断裂，核 浓縮、细胞质膜磷脂酰丝氨酸外翻、活性氧等细胞凋亡特征。脂肽诱导的细胞凋亡可能在解淀粉芽胞杆菌 对真菌的拮抗作用中起重要的作用，因为在自然生态中芽胞杆菌产生的脂肽可能并不足以导致细胞膜的穿 孔，但却可诱导凋亡的发生，这也部分解释了一定浓度的脂肽表现为抑菌作用而非完全杀死真菌。许多芽胞杆菌产生的生物活性剂物质能用于植物病害的生物控制，从而减少化学药物的使用来保护环境。抗真菌，肿瘤和病毒也使芽胞杆菌作为寻找新抗生素的生物资源。但是现在仅有很少的抗真菌物质被 分离鉴定，而且现在被鉴定的芽胞杆菌产抗菌物质多为枯草芽胞杆菌所产脂肽。我们分离到的解淀粉芽胞 杆菌产生的脂肽为分子量较火的脂肽，不同于以往报道的小分子量脂肽，该脂肽对水稻纹枯病菌、玉米小 斑病菌、棉花枯蒌病菌、小麦赤霉病、棉铃炭疽病菌、杨树溃疡病菌、灰霉菌等多种植物病原真菌具有显 著的拮抗效果。我们以丝状真菌水稻纹枯病菌以及酵母菌中的假丝酵母为代表进行研究，发现该脂肽促真 菌细胞凋亡的作用是其拮抗作用的重要表现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分离、筛选获得一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆 菌，分析该菌株是否具有能对植物真菌病原菌具有有很好拮抗作用的活性物质，申请人从水稻根系分离得 到了这株目的细菌。试验表明分离的这株细菌属于一株解淀粉芽胞杆菌，它能产生促真菌凋亡的一种脂肽， 可作为细胞凋亡研究的诱导物，也可作为抗植物病原菌的有效成分。本专利技术提供了分离筛选该解淀粉芽胞 杆菌的方法，对其产生的活性物质进行了表征分析，并对该活性物质的应用前景进行了试验，从而完成本 专利技术。实现本专利技术的技术如下所述申请人通过分离筛选获得一株分离的对植物真菌病原菌具有很好拮抗作用活性物质的微生物菌株 CH1,经16SrRNA分析和其他形态学等分析，确定该菌株为解淀粉芽胞杆齒(S""7/肌a，/o/i—e々c/era)， 申请人:将其命名为解淀粉芽胞杆齒(5ac(7/泌awj/o/i々恥/ac/e朋)CH1。该菌株已于2008年9月5日送交 湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏屮心〔CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO:M208127。从该解淀粉芽胞杆菌菌株CH1的培养物中获得具有生物活性物质，被表征为促真菌凋亡脂肽。该脂肽 的分子量为1065或它的同系物。具有如说明书附图6所示的的红外图谱。该脂肽由9碳烷基和8个氨基 酸组成，在第7个烷基碳与最后一个氨基酸通过一个氧原子形成环肽。其序列及构型如下CH3-(CH!2)5-CH-CH2-CO- Leu-Glu-Arg-Ala-Asp-Val-Lep- Leu 。O对该解淀粉芽胞杆菌菌株以及其制备的脂肽在细胞凋亡中的生物学应用前景进行了试验。具体制备步骤是这样的1.细菌的分离筛选与鉴定从中国湖北省武汉市华中农业大学水稻田取分蘖期的水稻分离具有抗水稻 纹枯病菌的细菌。对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。确定我们分离得到的是一 株解淀粉芽胞杆菌CBacWws. OT77yto/z々Me/ade"s)。2. 抗真菌活性物质的分离纯化及有效成分鉴定对上述获得的解淀粉芽胞杆菌培养2天后发酵液用 "两步萃取法"(见实施例1)提取抗菌活性物质，将萃取后液体真空旋转蒸发浓縮(见实施例1)，并溶于少量的蒸馏水中。用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进 行抗菌活性检测。在抗真菌活性分析后，对有活性的抗菌物质进行真空冷冻干燥进行浓縮(见实施例1)。浓缩的溶液 进行薄层层析分离，对各斑点进行抗菌活性检测，并对纯化的抗真菌物质进行定量。3. 抗真菌脂肽诱导真菌凋亡的各种特征检测。用步骤2纯化的脂肽处理假丝酵母和水稻纹枯病菌， 并利用荧光显微镜检测观察。实施结果通过16SrRNA分析和其它形态观察确定我们分离的菌株为 一解淀粉芽胞杆菌BacWw. a附y/0/Z3wey^c/eMS 。 该菌对i /2/zoc/ow/a so/aw', //e/'w力f/!ospon'w附附<3>^''5, ^wsan'w附qx> /30/7'kw, 5of 3*'s "."ereapers, G舰ere,/a Z)of/n'。re〃a gregaHa, Co〃"o加'c/!扁gas观"等植物病原真菌都有明显的抗菌效 果。我们成功的分离到了该菌株的抗真菌有效成分，并对其抗菌活性和基本特性进行了分析。随后用纯化 的脂肽处理假丝酵母和水稻纹枯病菌能很好的诱导其凋亡。用双苯甲亚胺(Hoechest 33258)染色能很明 显的看出脂肽处理的细胞能很好的被染色，也就是说其细胞膜通透性有较大改变，且丝状真菌纹枯病菌单 个细胞中细胞核数量超过23个，假丝酵母细胞核则呈明显的核浓缩现象。处理后细胞内活性氧水平也明 显高于对照组，Annexin V检测也显示脂肽处理细胞有较多细胞出现磷脂酰丝氨酸外翻，而对照组明显少 于处理组。缺口末端标记分析(TUNEL分析)同样显示处理组的细胞被染色多，说明细胞内DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株分离的产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＨ１，保藏在中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ），保藏编号为ＣＣＴＣＣ：Ｍ２０８１２７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：祁高富，赵秀云，朱发银，文凯，张世超，喻子牛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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