过度生产5’-黄苷酸的微生物制造技术

产氨棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＣＪＸＰＫ００１（保藏号：ＫＣＣＭ １０３４０），其是产氨棒杆菌ＫＦＣＣ １０７４３的突变株，对３，４－脱氢－ＤＬ－脯氨酸具有抗性，而且在低于３０ｍｇ／Ｌ浓度的３，４－脱氢脯氨酸中生长并产生５’－黄苷酸。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及过度生产5’-黄苷酸的微生物。更具体地说，本专利技术涉及产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJXPK001，其是产氨棒杆菌KFCC 10743的突变株，对3，4-脱氢-DL-脯氨酸具有抗性。众所周知，在早期从鱿鱼或其它鱼中提取少量的核苷酸以作为食物或药物部分的原料以后，已开发了其大规模生产的方法。在生产上述鸟嘌呤核苷酸的方法中，最普遍使用的是5’-黄苷酸(XMP)。上述5’-黄苷酸是生物合成嘌呤核苷过程中的中间产物，其通过XMP-谷酰胺酰胺转移酶转化为鸟苷酸。因此在生产5’-鸟苷酸的方法中采用首先生产5’-黄苷酸，再酶转化为5’-鸟苷酸的方法。然而为了大规模生产5’-鸟苷酸，需要相应量的5’-黄苷酸。因此需要大规模生产5’-黄苷酸的方法。生产5’-黄苷酸常用的方法有化学合成、由核糖核酸在酵母中分解得到的5’-鸟苷酸产物去氨基化、在发酵培养基中加入黄嘌呤作为前体物质的方法、使用微生物的突变株、加入抗生素物质(JP 1477/67和JP 20390/69)的方法、加入表面活性剂(JP3835/67和JP3838/67)的方法等等。其中，用微生物突变株直接发酵生产5’-黄苷酸的方法在工业生产方面是相当有利的。我们研究开发了通过使用产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)高产率地生产5’-黄苷酸的方法，其可工业应用于生产核苷酸如次黄嘌呤核苷酸和鸟苷酸，我们可以通过对产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)KFCC10743的现有特征的改性，提供能提高5’-黄苷酸的生产能力的突变株，并由此完成了本专利技术。为了达到上述目的，本专利技术提供3，4-脱氢脯氨酸抗体CJXPK001，其是产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)KFCC 10743的突变株。下面将对本专利技术做更详细的说明。为了避免因外部的渗透压而脱水，大多数微生物会通过在其体内积聚有机溶质如钾离子和渗压剂(osmolytes)来增加它们内部的渗透压。上述渗压剂包括脯氨酸，甜菜碱和肉毒碱(Beumer，R.R.，et al.，Appl.Environ.Microbiol.601359-1363，1994)，其中，脯氨酸是已知的控制渗透压的最重要的因素。此外，在Brevibacterium lactofermentum中，据报道，在通过细菌细胞外的5’-黄苷酸引起的增加的外部的渗透压下，由于生物合成过程中重要的酶--吡咯啉-5-羧化物还原酶活性的增加，脯氨酸在细菌细胞中积聚(Yoshio K.et al.，Agr.Bio.Chem.，53(9)2475-2479，1989)。另据报道，在大肠杆菌(E.coli)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，褪色沙雷氏菌(Serratia marcescens)和其它菌的情况下，L-脯氨酸在它们的细胞中积聚并由外部渗透压控制(V.J.Dunlap et al.，J.Bacteriol.，163296，1985)。通过提供已有的具有L-脯氨酸类似物抗性的产氨棒杆菌KFCC 10743，并通过用反馈抑制来清除对L-脯氨酸合成过程的抑制，可增强L-脯氨酸的合成能力，并进一步增加微生物的渗透压抗性特点。最后，我们可以开发高产率地生产5’-黄苷酸的突变株。更具体地说，在这个创新的研究中，我们采用产氨棒杆菌KFCC 10743作为母株，通过紫外照射和突变衍生物如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)依照普通的程序进行处理，并通过在微量培养基中加入0-50mg/L的脯氨酸类似物3，4-脱氢脯氨酸(Sigma Company)，如下列表1所示，来培养突变株。其中，在30mg/L 3，4-脱氢脯氨酸中生长的菌株被分离出来，命名为CJXPK001。并按布达佩斯条约于2001年12月7日被保藏在韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM 10340。表1 此外，依照如上述表1所示浓度在微量培养基中加入0-50mg/L的3，4-脱氢脯氨酸后，在30℃发酵培养5天。并在整个过程中仔细观察突变菌株CJXPK001和母株KFCC 10743的生长速率。结果显示在下列表2中。表2 +生长，-未生长如上述表2所示，母株产氨棒杆菌KFCC 10743在5mg/L 3，4-脱氢脯氨酸的脯氨酸类似物中显示出抗性，但在浓度水平大于10mg/L时没有生长。然而本专利技术所得的突变株CJXK200101在浓度水平高至30mg/L的3，4-脱氢脯氨酸中显示出抗性。作为发酵培养基可以是在本专利技术的突变菌株CJXPK001帮助下可被用于生产5’-黄苷酸的念珠菌(candidates)，由对微生物生长所必需的廉价的工业级的糖源材料(葡萄糖，果糖和/或其他包含上述两种的多糖的水解产物)、氮源(有机或无机的)、无机矿物盐所制成的任何培养基，稀有元素以及维生素。微生物菌种的保藏本专利技术的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJXPK001按照布达佩斯条约于2001年12月7日被保藏在韩国微生物保藏中心(简称KCCM，地址为361-221，Yurim B/D，Hongie-1-dong，Seodaemun-gu，SEOUL 120-091，Republic of Korea)，保藏号为KCCM 10340。然而下列实施例仅仅给出了本专利技术的一些例子，本专利技术的内容并不限于下列实施例。实施例1由30g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨，15g/L酵母提取物，2.5g/L氯化钠，3g/L脲，150mg/L腺嘌呤，150mg/L鸟嘌呤组成的5mL种培养基(pH7.2)被导入直径为18mm的已灭菌的试管中。用本专利技术所述的突变菌株CJXPK001接种后，以180rpm，30℃的条件振荡培养18小时(种子培养)。然后，作为发酵培养基，我们将A培养基(葡萄糖60g/L，硫酸镁10g/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L，腺嘌呤30mg/L，鸟嘌呤30mg/L，生物素100μg/L，硫酸铜1mg/L，盐酸硫胺5mg/L和氯化钙10mg/L，pH7.2)和B培养基(磷酸二氢钾10g/L，磷酸氢二钾10g/L，脲7g/L和硫酸铵5g/L)分别灭菌和调制。然后它们被分别导入到已灭菌的500mL锥形瓶中振荡，分别取29mL，10mL，并取1mL的上述种培养基在200rpm，30℃条件下接种并发酵90小时。其后，测定所得培养基中积聚的5’-黄苷酸的量，结果示于下列表3中(由5’-黄苷酸钠·7H2O得到积聚的5’-黄苷酸的浓度)。对比例1除采用母株产氨棒杆菌KFCC 10743之外，用实施例1所述同样的方法发酵并测定所得培养基中积聚的5’-黄苷酸的量，结果示于下列表3中。表3 如上面表3所示，本专利技术的突变株CJXPK001(实施例1)的5’-黄苷酸的产量比母株KFCC 10743(对比例1)高13％。实施例2将50mL实施例1所述的种培养基倒入500mL锥形瓶中振荡并灭菌。然后将本专利技术的突变株CJXPK001接种并以180rpm，30℃的条件振荡培养24小时(初级种子培养)。接着，将次级种子培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：金祯焕，郭荣贤，朴长熙，高恩圣，吴润锡，张裁永，李光镐，沈载益，韩钟权，朴英薰，
申请(专利权)人：CJ株式会社，
类型：发明
国别省市：