特效菌YPC-TA3及处理废水的方法技术

本发明专利技术属于处理废水中芳香羧酸的微生物菌株发明专利技术及利用该菌株处理废水的用途发明专利技术，本发明专利技术包括筛选纯化降解芳香羧酸的特效菌ＹＰＣ－ＴＡ３，以芳香羧酸为碳源的培养基筛选获得，为好氧菌，该菌株可降解废水中芳香羧酸，特别是苯二甲酸。本发明专利技术的特效菌降解时间短，降解效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术创造涉及特效微生物菌的筛选纯化及处理化工废水的方法。
技术介绍
对苯二甲酸(以下简称PTA)作为石油化工企业的重要产品之一，相应产生的废水排放量也相当大，其废水中COD高达几千甚至上万。由于PTA废水中的污染物多为芳香族化合物，同时PTA也是一种毒害性污染物，而且废水的处理难度较大，属于难生物降解的废水。因此深入研究开发高效廉价大规模工业化降解处理PTA废水的技术及装备具有十分重要的意义。现有各种处理PTA废水的技术均有一定的缺陷和不足。总的来说有的工艺复杂，构筑物多，基建投资大，出水质量一般有的污泥产量大，占地面积大，运行费用高。其主要的原因之一就是处理装置中有效菌含量低，杂菌含量过高，即缺少对污水中污染物具有高效降解作用的有效菌，尤其是针对PTA废水中具有的高效降解菌。本专利技术采用微生物筛选、纯化技术，从自然环境中获得原始菌株，以芳香羧酸为碳源进行纯化培养，获得对芳香羧酸具有高效降解作用的菌株，并测定其对COD及芳香羧酸的降解性能。测定结果，该菌降解性能优良，对芳香羧酸废水的生物处理有很大的应用价值。三、专利技术的内容本专利技术目的为了提供对芳香羧酸，特别是苯二甲酸具有高效降解作用的特效菌，所述特效菌为YPC-TA3，(Clavibacter xyliyzsc，保藏在CGMCC，保藏编号No.1201，保藏日期2004年8月3日)本专利技术另一目的是一种利用上述特效菌YPC-TA3处理废水的方法。本专利技术的技术构思从自然环境中获得原始菌株样本，进行筛选培养，获得初步菌株样本，接种后进行芳香羧酸降解性能测试，选取性能最好的为目标样本既特效菌。以下对本专利技术作进一步描述一、菌株分离筛选方法(一)试剂配制1.芳香羧酸贮备液称取40g纯对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)溶于1000ml蒸馏水中，用Na2CO3调节在7.2～7.7之间。2.富集培养液I牛肉膏0.1g，蛋白胨0.2g，NaCl 0.2g，溶于100ml蒸馏水中。3.富集培养液II牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，NaCl 0.2g，溶于100ml蒸馏水中。4.筛选培养基琼脂4g，Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)贮备液20ml，加蒸馏水至100ml。5.模拟废水Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)贮备液5ml，加蒸馏水至100ml。6.富集培养基琼脂0.6g，牛肉膏0.6g，蛋白胨0.6g，NaCl 0.4g，溶于100ml蒸馏水中。7.保存培养基Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，琼脂2g，对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)贮备液1ml，溶于100ml蒸馏水中。(二)筛选方法1、初筛第一步取芳香羧酸堆场上某处土壤约1g，用50ml富集培养液I室温摇床培养24小时。第二步将第一步获得的菌悬液稀释至10-5～10-6，在筛选培养基上涂布，培养48小时，进行驯化。第三步配制摸拟废水，测其COD，记为初始COD。第四步从第二步所制筛选培养基上生长的菌落中挑出18个，移入18瓶各含50ml富集培养液II的瓶中，室温摇床培养24小时。第五步将第四步获得的菌悬液各取10ml，离心12min，弃上清液，将沉淀物移入模拟废水中，在660nm波长处测定其吸光度，确定其菌体浓度。培养48小时，离心12min，取上清液做COD，记为终了COD。降解率＝(1-终了COD/初始COD)*100计算，降解率大于80％的进行保存。COD测定方法见GB11914-892、复筛先后使用了两种方法，对初筛获得的菌株作进一步筛选与纯化。方法一与初筛过程基本相同，区别在于用冰箱中保存的菌株代替芳香羧酸堆场的土壤。方法二取冰箱保存的菌株，从第四步开始与初筛各步骤相同。二、菌株YPC-TA3的生物学特性YPC-TA3菌株鉴定菌株鉴定依据为《伯杰氏细菌分类手册》(第八版)，鉴定到属。 对菌株进一步鉴定采用16s rRNA基因全序列分析1.16s rRNA基因全序列分析(1)菌体培养与收集干菌片在含1000mg/L的对苯二甲酸基本液体培养基中(以芳香羧酸为碳源)富集活化，涂布相同的固体平板，待菌落长出后，检查菌落的纯度与形态，YPC-TA3菌落小，呈半透明白色；挑取单菌落，接种于LB平板中。菌株经LB平板活化后，挑取单菌落接种于20mlLB培养液中，28℃恒温振荡(200r/min)培养，在对数生长期离心(4℃，12000rpm，10min)收集菌体。(2)总DNA的小量提取取1.5ml菌液5000rpm离心4min，去除上清，用1mlTE缓冲液清洗菌体，5000rpm离心4min，去除上清，以270μl TE缓冲液悬浮菌体。加入15μl溶菌酶溶液，于37℃水浴15min。加15μl 10％SDS，混匀。加10μl蛋白酶K，混匀，37℃水浴1h。加200ul 5M保存于4℃的Nacl，剧烈振荡。加500μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻振荡均匀，10000rpm离心10min，吸取上清液至新离心管中。加400ulTE缓冲液后，加500ul异丙醇混匀，置于-20℃过夜以充分沉淀DNA。取出后以10000rpm于4℃离心10min，去除上清，用70％于4℃预冷的乙醇洗沉淀3次，风干，溶于50μl TE(PCR反应专用)缓冲液中。(3)16s rDNA扩增体系的设计用于扩增供试菌株16s rDNA的PCR引物为P1和P6，它们来源于E.coli 16s rRNA基因序列的保守区域。引物P1和P6的序列如下正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′为Ecoli 8-27。反向引物5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，下游序列位于1492-1507碱基位置。上述引物由上海博亚公司合成。根据该公司产品说明，用无菌重蒸水将引物溶解至终浓度为100μM，于-20℃下保存。(4)PCR扩增反应依次于0.5ml PCR管中加入ddH2O、扩增缓冲液、dNTP、Taq酶、Mg2+、P1、P6和模板DNA。瞬间离心后置于PCR仪(Biorad icycle)中进行预变性(95℃，10min)，再进行扩增循环。本实验采用的循环条件为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，循环35次，循环结束后72℃延长10min，4℃保存。(5)PCR产物的检测、回收与纯化取2μl扩增产物与3μl无菌水、1μl上样缓冲液混匀后，在0.75％的琼脂糖凝胶板上进行电泳(5v/cm)。以DNA marker DL2000为标准分子量对照。电泳后经EB染色，于紫外灯下观察，检测扩增片段的长度和浓度，保存扩增成功的样品。PCR产物的回收纯化采用TaKaRa公司的PCR Fragment Recovery Kit试剂盒。(6)连接载体采用购自TaKaRa公司的PMD 18-T Vector。构建以下体系pMD 18-T Vector 1ul Insert DNA 1ulLigation Solution5uldH2O补足到10ul于16℃反应过夜。(7)培养DH5a感受态细胞接种单菌落至5ml L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解废水中芳香羧酸，特别是降解对苯二甲酸的特效菌株，其特征在于：所述菌株为ＹＰＣ－ＴＡ３，Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｙｚｓｃ，保藏在ＣＧＭＣＣ，保藏编号Ｎｏ．１２０１，保藏日期２００４年８月３日。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊，郑国洋，黄勇，朱建忠，章晓春，王桂林，周立进，王洪丽，陆建华，罗翔，喻敬周，
申请(专利权)人：扬子石油化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]