利用丁香假单胞菌制备假单胞霉素制造技术

描述了制备一或多种假单胞霉素的方法，包括培养可生产一或多种假单胞霉素的丁香假单胞菌的方法，而这些假单胞霉素都含有通式（Ⅰ），其中的Ｒ指亲脂性基团。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2000年4月14日，申请号为00806262.5，专利技术名称为“利用丁香假单胞菌制备假单胞霉素”的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及生产一或多种假单胞霉素的方法，以及培养可生产一或多种假单胞霉素的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的方法。
技术介绍
真菌感染是引起人类，尤其是在患有免疫缺陷的人中引起疾病、生活质量降低以及死亡重要原因。在过去的20年里真菌感染的发生有很大的增加。这部分要归因于患有由器官移植、癌症的化学治疗、AIDS、年龄以及其他的类似紊乱或病情引起的免疫系统削弱或毁坏的病人的增加。这些病人易于受真菌病原的攻击，而这些病原是通过数量众多的菌体来作用，而这些菌体又是在正常发挥功能的免疫体系的监控之下的。这些病原是很难控制的，原因在于现存的抗真菌药物不是高毒性的就是仅仅抑制真菌的活性。例如，多烯烃是杀真菌的，但却是有毒性的；而吡咯类毒性很小但却是仅仅抑制真菌的。更重要的，最近有报道出现假丝酵母的抗多烯烃和吡咯类的菌株，这就严重限制了对这些菌株的治疗方案的选择。 一类新的抗真菌药物—假单胞霉素(psendomycin)在治疗多种患有真菌感染的病人上展示出了希望。(见如Harrison，L.，et al.，″Pseudomycins，a family of novel peptidcs from丁香假单胞菌possessing broad-spectrum antifungal activity，.″J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-65(1991)and US Patent Nos.5,576,298and5,837,685)。假单胞霉素是从丁香假单胞菌分离株中得到的天然产物。丁香假单胞菌是一大族与植物相联系的细菌，它们是多种具有生物活性的物质如杆菌肽和丁香霉素的来源物质。丁香假单胞菌的天然菌株及由转座子突变产生的突变体可产生具有生物活性的化合物。P.syringae MSU174的野生型菌株的一株由转座子突变产生的突变株MSU16H(ATCC 67028)可产生多种假单胞霉素。已经对假单胞霉素A、B、C及C′进行了分离和化学特性鉴定，结果表明它有广谱抗真菌活性，这包括抵抗人体内和植物体内的重要真菌抗原的活性。假单胞霉素在结构上与从丁香假单胞菌中分离到的丁香霉素和其他的抗真菌物质相关连，但它与他们相比却是截然不同的物质。假单胞霉素A、B、C及C′肽段与L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-LThr(4-Cl)相对应的部分与羧基末端在N-末端Ser的-OH上闭合成大环。这些类似物以N-酰基侧链来区分，例如假单胞霉素A是由3，4-二羟基十四烷酸盐进行N-酰基化；假单胞霉素B是由3-羟基十四烷酸盐进行酰基化的；假单胞霉素C是由3，4-二羟基十六烷酸盐进行酰基化的，而假单胞霉素C’是通过3-羟基十六烷酸盐来进行酰基化的。(见如Ballio，A.，et al.，″Novel bioactive lipodepsipeptides ftom丁香假单胞菌the pseudomycins，″FEBS Letters，355(1)，15 96-100，(1994)and Coiro，V.M.，et al.，″Solution conformation of the丁香假单胞菌MSU 16H phytotoxic lipodepsipeptide pseudomycin Adetermined by computer simulations using distance geometryand molecular dynamics from NMR data，″Eur.J.Biochem.，257(2)，449-456 (1998).) 尽管真菌感染流行和利用假单胞霉素进行治疗的希望都在增加，但商业规模的假单胞霉素生产存在着很多的问题。已经出版的那些生产假单胞霉素的方法是在以昂贵的马铃薯葡萄糖为培养基、在不用摇动和搅拌的情况下培养的。一般来讲，这些培养方法可生产少量的、可用于实验室研究的假单胞霉素，而其浓度是不适合于大规模或商业规模的生产。现有的方法也不适合于大约1升以上规模的生产，在这样的规模生产中对营养物质、气体尤其是氧气进行扩散以保证细胞的充分生长是一个问题。 现在需求的是一种可以利用P.Syringae来生产商业规模的、可进行商业应用的假单胞霉素，从而将其作为抗真菌药物来抵抗动物、人类及植物的真菌感染。 专利技术概述 本专利技术提供了利用微生物来生产抗真菌药物如一或多种假单胞霉素的方法。这些方法包括利用含有三种或少于三种氨基酸的培养基培养丁香假单胞菌，以及从培养物中回收一或多种假单胞霉素。这三种或少于三种的氨基酸包括谷氨酸、甘氨酸、组胺酸以及他们的组合。在一种实施方案中，丁香假单胞菌是在含有甘氨酸及任选脂质、马铃薯产品或其组合之一的培养基中、在pH大约4到6.5的条件下进行培养，直至一或多种假单胞霉素的浓度至少为大约10μg/ml.，优选大于大约40μg/mL。这种培养方法尤其对在一定规模条件下生产一或多种假单胞霉素有用，而这样的规模是可充分用于回收作为动物、人类或植物抗真菌药物的假单胞霉素的。此外，本专利技术也提供了利用上述方法制备的假单胞霉素。 本专利技术还涉及丁香假单胞菌菌株的生物纯化培养物，这些培养物对于生产假单胞霉素非常有用。丁香假单胞菌菌株可以是从环境资源，包括植物，如大麦类植物、柑橘类植物、丁香类植物等等中分离到的的野生型菌株；也可以是从环境分离物中筛选的菌株，以及这些菌株的突变株。优选的环境分离物是植物。优选的丁香假单胞菌的特征包括能在不含马铃薯产品的培养基上或基本培养基上生长并产生一或多种假单胞霉素的能力；可产生明显量的假单胞霉素；至少大约是10μg/ml，产生所需的分布(distribution)的假单胞菌素和/或抑制一或多种真菌。 按照本专利技术，丁香假单胞菌能够在含有三种或少于三种氨基酸及从油脂、马铃薯产品和他们的组合中任选一种的培养基上生长，直至产生的一或多种假单胞霉素的浓度至少约有10μg/mL优选的是丁香假单胞菌菌株产生的一或多种假单胞霉素的浓度约为40μg/mL-700μg/mL，而最优选的是大约200μg/mL的假单胞霉素A或至少大约100μg/mL的假单胞霉素B。 在本方法的一种优选实施方案中，通过分批培养或连续培养丁香假单胞菌生产了一或多种假单胞霉素。丁香假单胞菌要有足够的生长时间和浓度来提高假单胞霉素的产量。优选的是培养物的pH保持在约为4-6.5，更优选的是4.5-5.5，这样可以保持假单胞霉素的稳定性。 定义 此处所用到的名词“假单胞霉素”指含有式I的化合物 其中R是亲脂性基团。假单胞霉素化合物A，A′，B，B′，C，C′是由上式I来代表的，其中的R定义如下。 假单胞霉素AR＝3，4-二羟基十四烷酰 假单胞霉素A’R＝3，4-二羟基十五烷酸盐 假单胞霉素BR＝3-羟基十四烷酰 假单胞霉素B’R＝3-羟基十二烷酸盐 假单胞霉素CR＝3，4-二羟基十六烷酰 假单本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产一或多种假单胞霉素的方法，该方法包括以下步骤：在基本上由三种或少于三种氨基酸组成的营养培养基中，在ｐＨ大约为４．０－６．５的条件下，培养丁香假单胞菌的生物学上的纯培养物，直至产生的一或多种假单胞霉素的浓度达到至少大约１０μｇ／ｍ ｌ；并且从培养物中回收一或多种假单胞霉素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MD希尔顿，小RJ斯特罗贝尔，PJB米勒，DN托马斯，AR科克肖特，BG格特曼，JR伊斯特里德格，CA坎特维尔，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]