利用肠道菌高细胞密度发酵生产１，３－丙二醇的方法是一种生物发酵制备１，３－丙二醇的方法，其工艺过程为：种子培养过程：肠道菌菌种经活化后，接种至无菌种子培养液中；发酵培养液培养过程：发酵培养液经灭菌冷却后，以体积比３～１５％的接种量将种子液接种于装有发酵培养液的发酵罐中；分批发酵菌体快速生长期：发酵培养液中碳源的浓度稳定在０．１～３０ｇ／Ｌ；高细胞密度发酵期：当菌体密度达到ＯＤ↓［６５０］２．０～５．０；采取营养基质限制性补加和空气限制性供给的方式；有产物合成时，同时向发酵罐中供入能被菌体生长与转化利用的氮源、磷酸盐、无机离子、微量元素、Ｖ↓［Ｂ１２］中的一种或多种的组合，同时流加甘油；当发酵过程不再产酸，发酵过程结束。
【技术实现步骤摘要】
,3－丙二醇的方法
本专利技术是一种生物发酵制备1，3-丙二醇的方法，属于1，3-丙二醇的生物催化合成
技术介绍
1，3-丙二醇是一种重要的有机合成原料和中间体，具有广泛的应用。1，3-丙二醇可以用于增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成；也用于食品、化妆品和制药等行业。它可与异氰酸酯反应生成聚氨酯，是生产聚氨酯的重要单体；特别是1，3-丙二醇可与对苯二甲酸反应，聚合成PTT聚酯纤维，这种新型聚酯材料不但具有易于自然循环的可生物降解特性，而且具有优异的回弹性、染色性、抗污性等。在地毯、工程塑料、服装材料等应用领域大有作为，是目前合成纤维新品种开发的热点。虽然早在1941年PTT就合成成功，但是价格昂贵的原料1，3-丙二醇阻碍了它的发展。据Schell公司预测，到2010年世界PTT纤维需求量将超过100万吨，届时，对1，3-丙二醇的需求也将直线上升。目前1，3-丙二醇的生产方法分为如下几种(1)Shell公司开发的环氧乙烷法，该法以环氧乙烷为原料，在催化剂的作用下与CO反应制备3-羟基丙醛，3-羟基丙醛在Ni催化剂作用下催化加氢制1，3-丙二醇。(2)Degussa公司开发的丙烯醛法，该法以丙烯醛为原料，在酸性催化剂或离子交换剂的作用下与水进行双键水合制得3-羟基丙醛，再转化为1，3-丙二醇。(3)生物发酵法在微生物催化作用下，将可发酵性碳源发酵转化为1，3-丙二醇。(4)其它的方法如日本帝人公司正在探讨将乙烯转化为1，3-丙二醇的技术路线，该技术路线的化学过程较复杂，但所用原料乙烯价廉易得。上述的用于合成1，3-丙二醇的化学方法，都不适用于工业大规模生产1，3-丙二醇，化学方法生产成本较高，技术难度高，特别是催化剂的制备较困难。同时化学法不仅消耗了不可再生的有限资源，而且会对环境造成污染。而发酵法利用淀粉、葡萄糖或甘油(可由葡萄糖发酵而得)等可再生资源为原料，生产成本相对较低，且产品选择性好、转化率高、产物分离简单，生产清洁，对环境无污染等优点。因此，研究利用微生物生产1，3-丙二醇的工作已倍受关注。肠道细菌代谢甘油合成1，3-丙二醇存在着两条代谢路线一条是氧化途径，提供用于细胞生长和生成NADH的能源与碳源，该途径为甘油在甘油脱氢酶、二羟丙酮激酶等的作用下，转化为丙酮酸，再通过厌氧酵解途径，生成乙酸、乙醇、乳酸等副产物。此路径是生成生物能ATP和还原当量NADH的过程。以克雷白氏肺炎杆菌和柠檬菌为例，(1)(2)另一条是还原途径，甘油通过甘油脱水酶、1，3-丙二醇氧化还原酶合成1，3-丙二醇。在此路径中，1，3-丙二醇不再被进一步代谢掉，因此会有一个高浓度积累，(3)(4)菌体内的氧化途径和还原途径是通过NADH/NAD+以及能量ATP/ADP耦联在一起的。在氧化途径中，产生NADH；在还原途径中，NADH作为1，3-丙二醇氧化还原酶的电子供体。氧化途径还为还原途径的转化过程提供了能量，同时也是菌体生长代谢的一部分。利用肠道菌发酵生产1，3-丙二醇，细胞的生长与产物的合成是相互关联的，微生物细胞的生长始终贯穿发酵的全过程。但是目前发酵法生产1，3-丙二醇存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题，导致缺乏市场竞争力而无法大规模生产。因此提高发酵的生产强度和转化率是工业化生产成本的关键。文献所报道的发酵工艺在考虑如何提高甘油转化率时，一般采用发酵过程厌氧转化，厌氧发酵存在一个生长的停滞期，菌体生长缓慢，导致发酵过程中生物量偏低，影响代谢反应速率，导致生产周期长，生产强度低，且发酵终期底物残留，因此提高发酵过程中的生物量，采用高细胞密度发酵对于提高生产强度、缩短生产周期是很重要的。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于提供一种能提高生物发酵制备1，3-丙二醇工艺过程生产强度、缩短生产周期、降低生产成本的，3-丙二醇的方法。技术方案本专利技术的方法是提供一种使微生物细胞能够在分批发酵期以大的比生长速率生长的多步骤分批发酵方法，所涉及到的肠道菌可以是克雷伯氏菌(Klebsiella)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)、产气克雷伯氏菌(klebsiallaaerogenes)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。本专利技术采用分批发酵方式的高细胞密度发酵工艺过程为1)种子培养过程肠道菌菌种经活化后，接种至无菌种子培养液中，35℃～38℃、置于摇床进行好氧种子培养，直至菌体密度达到OD650≥4.0；2)发酵培养液培养过程发酵培养液经灭菌冷却后，加消泡剂，以体积比3～15％的接种量将种子液接种于装有发酵培养液的发酵罐中，中间每隔2～4小时取样，测菌体浓度、碳源浓度和产物1，3-丙二醇浓度；3)分批发酵菌体快速生长期发酵培养液中碳源的浓度稳定在0.1～30g/L，向发酵培养液内通入空气，将溶解氧控制在DO5～25％，保持菌体快速生长；控制温度34～38℃，pH5～8，时间2～5小时；4)高细胞密度发酵期当菌体密度达到OD6502.0～5.0；采取营养基质限制性补加和空气限制性供给的方式，使细胞只有少量的生长，以高强度产物合成为主；5)有产物合成时，同时向发酵罐中供入能被菌体生长与转化利用的氮源、磷酸盐、无机离子、微量元素、VB12中的一种或多种的组合，同时流加甘油，使甘油浓度保持在20～40g/L。6)当发酵过程不再产酸，发酵过程结束，生产出1，3-丙二醇。发酵培养液或种子培养液中具备肠道菌生长所需的营养成分，包括碳源、氮源、磷酸盐、硫酸盐及其它营养源；其中碳源为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、异麦芽糖等，浓度范围0.1～30g/L；氮源是胨、玉米浆、酵母膏、酵母粉、(NH4)2SO4、NH4Cl、半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸，浓度范围0.1～10g/L；磷酸盐是磷酸根离子；其它营养源为无机盐类钾、钠、镁、钙金属盐和微量元素锌、铜、硼、钼、镍，微量元素含量在0.01～50mg/L。限制性补加的营养基质是氮源、或磷源，或氮源加磷源，氮源为胨、玉米浆、酵母膏、酵母粉、(NH4)2SO4、NH4Cl、半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸；磷源为磷酸根离子；浓度范围0.1～10g/L。空气限制采取减少通气量、上保压、空气通气量0～3.0V/Vmin或通氮气0.3～3.0V/Vmin。营养基质补加的方式是恒速流加、或变速流加、或指数流加、或一次性补加；在该阶段还需要补加甘油以保证有足够的甘油转化成1，3-丙二醇，甘油浓度保持在20～40g/L。有益效果本专利技术提供了一种使肠道菌细胞能够在分批发酵期以大的比生长速率生长的多步骤分批发酵方法。在给定的条件下，保证了高的生产强度，使整个生物转化工艺周期短，底物无残留或低残留，又可获得较高的1，3-丙二醇浓度和高的摩尔转化率。本发酵工艺简单经济，提高了反应器生产强度，缩短了发酵周期，降低了生产成本，又有利于后提取工艺，为生物合成1，3-丙二醇的工业化提供了简单快速经济的发酵工艺，极大地提高在市场上的竞争力。针对利用肠道菌发酵甘油合成1，3-丙二醇的技术路线中，微生物的生长与产物的合成相互关联、生产菌的生长性能对产物的合成具有显著影响的特性，采取多步骤分批发酵方法，即在发酵前期通过向发酵罐中通气供氧、提供微生物生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用肠道菌高细胞密度发酵生产１，３－丙二醇的方法，其特征在于采用分批发酵方式的高细胞密度发酵工艺，其工艺过程为１）种子培养过程为：肠道菌菌种经活化后，接种至无菌种子培养液中，３５℃～３８℃、置于摇床进行好氧种子培养，直至菌体密度 达到ＯＤ↓［６５０］≥４．０；２）发酵培养液为：发酵培养液经灭菌冷却后，加消泡剂，以体积比３～１５％的接种量将种子液接种于装有发酵培养液的发酵罐中，中间每隔２～４小时取样，测菌体浓度、碳源浓度和产物１，３－丙二醇浓度；３）分 批发酵菌体快速生长期：发酵培养液中碳源的浓度稳定在０．１～３０ｇ／Ｌ，向发酵培养液内通入空气，将溶解氧控制在ＤＯ５～２５％，保持菌体快速生长；控制温度３４～３８℃，ｐＨ５～８，时间２～５小时；４）高细胞密度发酵期：当菌体密度达到ＯＤ ↓［６５０］２．０～５．０；采取营养基质限制性补加和空气限制性供给的方式，使细胞只有少量的生长，以高强度产物合成为主；５）有产物合成时，同时向发酵罐中供入能被菌体生长与转化利用的氮源、磷酸盐、无机离子、微量元素、Ｖ↓［Ｂ１２］中的一 种或多种的组合，同时流加甘油，使甘油浓度保持在２０～４０ｇ／Ｌ。６）当发酵过程不再产酸，发酵过程结束，生产出１，３－丙二醇。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敏，马全红，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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