本发明专利技术提供一种５－氨基－４－氨甲酰咪唑核苷的产生菌及生产５－氨基－４－氨甲酰咪唑核苷的方法，所提供的微生物菌株是经选育的枯草芽孢杆菌ＸＧ１５ ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０５０４０。用该菌株做发酵菌株，利用糖质原料进行发酵，摇瓶发酵５０－８０小时，可产５－氨基－４－氨甲酰咪唑核苷（ＡＩＣＡＲ）１０－２０ｇ／ｌ。它为工业发酵生产５－氨基－４－氨甲酰咪唑核苷（ＡＩＣＡＲ）提供了一种可行方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种可产生5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的微生物菌株及利用该菌株发酵生产5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(以下简称AICAR)的方法。
技术介绍
目前市场上销售的鸟苷酸及其钠盐鸟苷酸钠对人体有促进白细胞的增生、促进血管平滑肌舒张和活化肝功能的作用，临床上用于各种原因引起的白细胞减少症，也可用于急慢性肝炎和中毒性肝炎，同时，鸟苷酸钠与肌苷酸钠混合做成的食品增鲜剂的I+G(肌苷酸钠+鸟苷酸钠)的市场需求量越来越大，而鸟苷酸一般是由5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)通过有机化学合成方法制造；同时，AICAR还可作为合成2-巯基肌苷及异丙肌苷的原料，而2-巯基肌苷及异丙肌苷作为饲料添加剂有增强动物免疫的作用，目前用量越来越大；但现在的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)是由各种有机材料通过化学合成法进行生产，该方法存在成本较高、对环境污染大及产生的污染物难处理等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷产生菌以及采用该菌株发酵制备5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的方法，以避免用化学合成法生产5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)所存在的问题。本专利技术所提供的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷产生菌是经选育的枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis)XG15，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC M205040。该菌株以下简称枯草芽孢杆菌XG15 CCTCCM 205040。本专利技术所提供的菌株是以枯草杆菌肌苷产生菌GMI-741为出发菌株，采用菌体亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线、氯化锂等多因子诱变选育出一株的，具有腺嘌呤脱氨酶缺失、非精确嘌呤缺陷型的枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)XG15，该菌株摇瓶发酵72小时可产5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)20.3g/L。本枯草芽孢杆菌XG15 CCTCC M 205040在保藏斜面上28～34℃培养12～18小时，保藏斜面培养物呈乳白色，其适宜培养条件为1.培养物(肉汤平皿或保藏斜面培养基同)蛋白胨3～6g/l，牛肉膏10～18g/l，酵母膏5～10g/l，琼脂15～25g/l。2.培养温度25℃～35℃。培养物pH值6.5～7.5；在液体活化培养基中，28℃～34℃，培养12～18小时，每毫升菌数在2.0×109以上，pH值约6-8，培养后的液体静止一段时间有乳白色菌体沉淀，其适宜生长条件为1.培养物葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米浆4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鸟嘌呤0.010～0.040。2.培养温度25～35℃。3.培养pH值6.0～8.0。4.培养方法培养18-24小时的斜面种子接入装有20ml液体活化培养基的500ml三角瓶(0.07Mpa灭菌10min.)中，32℃于往复式摇床振动培养12-20小时。本专利技术所提供的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制备方法，其特点是用枯草芽孢杆菌XG15CCTCC M 205040做发酵菌株，利用糖质原料进行发酵。所说的糖质原料可为葡萄糖、淀粉双酶水解糖(用糖化酶和α-淀粉酶水解)等，摇瓶发酵50-80小时，可产5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)10-20g/l。它为工业发酵生产AICAR核苷提供了一种可行方法。利用本枯草芽孢杆菌XG15 CCTCC M 205040摇瓶发酵制备5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)的具体工艺过程如下(1)斜面菌种活化将培养好的保藏枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M205040斜面种划线于新配制的活化斜面上进行菌种活化。所述的活化斜面组成如下葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米浆4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鸟嘌呤0.010～0.040，琼脂20-25g/l，pH6.5-7.5。28-34℃培养18-24小时。培养好的保藏斜面种保藏时间最长不要超过半年。(2)菌种的液体活化将培养好的活化斜面种接一环于液体活化培养基中，使液体种的菌数达2.0×109个/ml以上。所述的液体活化培养基组成如下葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米浆4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鸟嘌呤0.010～0.040，起始pH6.5-7.5。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于28-34℃往复式摇床振荡培养12-18小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm。液体种的菌数可达2.0×109个/ml以上。(3)摇瓶发酵按体积百分比为2～10％接种量，接入糖质原料发酵培养基中，在往复式摇床振荡培养，待残糖下降至3g/l以下时，停止发酵。所述的发酵培养基(组成同液体活化培养基)可用500ml三角瓶装，装量20ml，于32-38℃，冲程65-80mm，转速90-130r/m的往复式摇床振荡培养60-80小时，待残糖下降至3g/l以下时，停止发酵。适宜的发酵培养基成份如下(按每升培养基所含克重g/l计算)糖100～140，玉米浆10～20，酵母粉15～20，硫酸铵8～15，磷酸二氢钾1～3，碳酸钙10～30，尿素2～6，硫酸镁0.5～1.5，pH6.5～7.5，其中碳酸钙单独称入三角瓶中，尿素分开灭菌。(4)将发酵完毕的摇瓶发酵醪液离心，取上清液，即得含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷发酵醪液。对含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷发酵醪液，可采用以下纸层析分析AICAR核苷含量发酵液下摇瓶后，用4000r/m转速的离心机离心10分钟，用50ul微量进样器点3号层析纸，硫酸铵作展开剂，展层5～10小时，烘干，用紫外分析仪照出AICAR核苷斑点，剪下斑点，用0.001mmol/l的HCl浸泡1-4小时。用752紫外分光光度计于260nm波长处测定紫外光吸收值，计算发酵醪液含AICAR核苷量。本专利技术中最大的特点在于用微生物发酵法生产AICAR核苷，比以往通常采用的化学合成法的成本有较大的降低，且对环境的污染小，；本专利技术在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产AICAR核苷最高可达20.3g/l。具体实施例方式实施例一将4℃冰箱内保藏的保藏枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面种，转接到新配置的活化斜面培养基上，活化斜面培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨10，酵母膏10，鸟嘌呤0.025，琼脂20，pH7.0。经32℃恒温培养20小时后，接一环于液体活化培养基中，液体活化培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4，玉米浆6，蛋白胨10，酵母膏10，鸟嘌呤0.025，pH7.0。液体活化培养基于32℃水浴摇床(冲程70mm、转速96r/m)振荡培养15小时，这时，菌液浓度一般0D(菌液稀释20倍，用721分光光度计650nm波长、1cm比色皿，蒸溜水作参比，测定光吸收值)达0.7以上。取1ml菌液(5％接种量)，接入发酵培养基中，发酵培养基的组成(g/l)如下葡萄糖110，玉米浆12，酵母粉18，硫酸铵10，磷酸二氢钾1，硫酸镁1，尿素5(分开灭菌)，CaCO3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种５－氨基－４－氨甲酰咪唑核苷的产生菌，其特征在于该微生物菌株是经选育的枯草芽孢杆菌ＸＧ１５ＣＣＴＣＣＭ２０５０４０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：施庆珊，林小平，许虹，李良秋，邱玉棠，陈仪本，欧阳友生，谢小保，黄小茉，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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