本发明专利技术公开了ＨＩＶ－１耐药性毒株及其应用，目的是提供一种拉夫米定ＨＩＶ－１耐药性毒株及其在抗艾滋病病毒药物筛选上的应用。本发明专利技术所提供的病毒株为３ＴＣ ＨＩＶ－１耐药性毒株ＣＧＭＣＣ № １１４０，对拉夫米定（３ＴＣ）的半数抑制浓度（ＩＣ↓［５０］）＞２０４８μＭ，具有传代稳定性，可广泛用于抗艾滋病药物的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及HIV-1耐药性毒株及其应用。
技术介绍
我国目前出现了艾滋病发病的高峰，截止2003年9月底，我国现存活的HIV感染者多达84万。从2002年起四种国产抗艾滋病病毒药物上市，使艾滋病人一年的治疗费用由原先的4万元人民币下降到目前的3500元左右。新的抗艾滋病药物的发现无疑是广大艾滋病患者的福祉，但同时也出现了HIV病毒产生耐药性的严重问题。根据国家药监局药审中心的要求，在评价抗艾滋病药物药效时，必须采用三种病毒(实验株、临床分离株、耐药株)进行体外实验。我国对HIV病毒耐药性尚缺乏系统的研究，目前为止还没有一株应用于艾滋病新药评价和HIV-1耐药性研究的标准耐药毒株。同时，在我国刚刚开始的HIV-1耐药性研究中，也由于没有HIV-1标准耐药性毒株而受到了很大制约。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种HIV-1耐药性毒株。本专利技术所提供的HIV-1耐药性毒株名称为3TC HIV-1，分类命名是人类免疫缺陷病毒，已于2004年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1140。3TC HIV-1耐药性毒株(CGMCC № 1140)对拉夫米定(3TC)的半数抑制浓度(IC50)＞2048μM，超过野毒株113,778倍；病毒pol区184位密码子由甲硫氨酸(M)突变为异亮氨酸(I)。该病毒株对3TC高度耐受，对ABC、DDC、DDI低度耐药，对AZT、D4T、TDF等核苷类逆转录酶抑制剂及DLV、EFV、NVP等非核苷类逆转录酶抑制剂仍保持敏感。经传代培养证实，该病毒株具有传代稳定性。本专利技术专利技术人在生物安全三级实验室中用HIV-1CNHN24毒株培育筛选HIV-1耐药性毒株，成功筛选出了中国第一株可稳定传代的拉米夫定(3TC)HIV-1耐药性毒株，该毒株做为模型，可广泛应用于治疗艾滋病药物的筛选，在抗艾滋病研究领域将占据重要地位，具有深远的理论及实践意义。具体实施例方式实施例1、3TC HIV-1耐药株的培育与筛选一、实验材料 1、病毒HIV-1CNHN24毒株，该毒株于2002年分离自中国河南艾滋病人外周血淋巴细胞，Genbank注册号AY180905，基因型为B’亚型，HIV抗体免疫印迹检测的带型是gp160、gp120、p66、p55、gp41、p24、p17。2、细胞MT4细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液培养和传代。3、筛选药物3TC药物为葛兰素史克制药公司生产的贺普丁拉米夫定片，每片含100mg拉米夫定。将100mg3TC溶解于50ml RPMI1640培养液中，经离心过滤，得到8.7mM3TC溶液，用前稀释成所需浓度。4、细胞培养基含10％小牛血清的RPMI1640细胞培养液。二、3TC HIV-1耐药株的培育将5×104-8×104/ml的MT4细胞悬液10ml加入到50ml细胞培养瓶中，接种终浓度为100TCID50的HIV-1CNHN24病毒，将浓度逐渐增加的3TC加到MT4-HIV-1CNHN24培养系统中，3TC起始浓度为0.008μM，略低于3TC对HIV-1CNHN24野毒株的IC50(0.018μM)，以后每代药物浓度以2倍递增，在37℃、5％CO2条件下培养，每天定时观察细胞病变。第1-4代每代培养5天，第5-8代每代培养6天，第9和第10代培养7天，共传代培养10代，第10代3TC浓度为4.096μM，为第1代的512倍。对照设病毒对照，为不含3TC药物的MT4-CNHN27培养物。重复每代病毒设2个平行样品。将病毒培养10代之后，3TC药物浓度已升高到4.096μM，病毒所致细胞病变仍十分明显；而将此浓度加到野毒株上，则可完全抑制野毒株的复制，细胞无病变出现，证明体外培养10代之后，筛选到的毒株对3TC高度耐药。三、3TC HIV-1耐药株的耐药性测定1、表型耐药性测定5块96孔细胞培养板分别用于测定3代、5代、6代、7代和10代3TC HIV-1耐药病毒。各培养板中每孔加入50μl细胞浓度为5×104个/ml的MT-4细胞。将3TC药物溶液用RPMI1640培养基进行2倍系列稀释，取不同稀释度3TC药物溶液50μl加入各培养板细胞孔中，每个稀释度作4个复孔。取以上各代病毒稀释为1∶500的浓度，在相应的培养板各孔中分别加入100μl病毒。将各培养板在37℃、5％CO2条件下培养，每天定时观察细胞病变，共培养7天，测定以上各代培养病毒的IC50。2、基因型耐药性测定用德国QiaGen公司的QIAamp viral RNA分离试剂盒从培养上清中提取病毒RNA，进行毒株基因测定。首先，对病毒RNA进行反转录在管中加入11μl RNA，2μl随机引物(Promega，1μl 20μg)，70℃孵育5min，立即冰浴2min，然后依次加入5μl dNTP，1μl M-MLVReverse(Promega，200U/μl)，5μl M-MLV 5×buffer，1μl Rnasin Ribonuclease Inhibitor(Promega，40U/μl)，40℃孵育2h，即可获得cDNA。然后，对所得cDNA进行套式PCR扩增，第一轮反应系统包括2μl cDNA模板；0.5μl dNTP(Takana，每种各10mM)；2.5μl 10×buffer；0.25μl Taq(Takana，5U)；上下游引物各1μl(外侧引物为5’-CCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGG-3’和5’-AACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCA-3’)；用水补足体积至25μl。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸7min。第二轮反应系统包括2μl第一轮PCR产物；1μl dNTP(Takana，每种各10mM)；5μl 10×buffer；0.5μl Taq(Takana，5U)；上下游引物各2μl(内侧引物为5’-ACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGA-3’和5’-CATTTATCAGGATGGAGTTCATA-3’)；用水补足体积至50μl。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。反应完毕，将所得PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，观察结果，选取阳性结果送上海博亚生物技术有限公司进行纯化与测序。3、测定结果3代、5代、6代、7代和10代病毒的测定结果如表1所示，结果表明在整个培养过程中病毒的IC50逐代增加，6代以前增加速度相对缓慢，第7代IC50突然有了大幅度提高，增加值超过野毒株113,778倍，显示其对3TC已产生了高度耐药性。病毒pol区184位密码子在第7代由蛋氨酸(ATG)突变为异亮氨酸(ATA)。登录http//hivdb.stanford.edu用Stanford HIV drug resistance database进行分析，可知该突变可导致对3TC高度耐受，对ABC、DDC、DDI低度耐药，对AZT、D4T、TDF等核苷类逆转录酶抑制剂及DLV、EFV、NVP等非核苷类逆转录酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
３ＴＣＨＩＶ－１耐药性毒株ＣＧＭＣＣ№１１４０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李敬云，李珏，鲍作义，刘思扬，庄道民，李韩平，刘永健，李林，杨坤，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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