制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备基因工程固定化酶Ｎ－糖酰胺酶（ＰＮＧａｓｅ）的方法，即利用基因工程技术将Ｎ－糖酰胺酶与酵母性凝集因子相融合，锚定在甲醇营养型酵母细胞表面，获得一种利用细胞作为载体固定化的Ｎ－糖酰胺酶。本发明专利技术的方法在固定化过程中酶活性不下降，制得的固定化酶稳定性高，可以重复利用、省去了纯化，大大降低Ｎ－糖酰胺酶的生产成本，其生产的Ｎ－糖酰胺酶可广泛用于规模化的从农副产品下脚料（蛋黄粉、牛奶）中提取具有生物功能寡糖链。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种制备基因工程固定化酶Ｎ－糖酰胺酶（ＰＮＧａｓｅ）的方法，由下述步骤组成；（１）重组表达载体的构建：克隆出Ｎ－糖酰胺酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｎ－（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－β－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ）ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　ａｍｉｄａｓｅ（ＰＮＧａｓｅ，ＥＣ３．５．１．５２）基因，经酶切后插入大肠杆菌载体，命名为ｖｅｃｔｏｒ－ＰＮＧ；然后克隆出酵母性凝集因子Ｃ－末端锚定位点基因，经酶切后插入到ｖｅｃｔｏｒ－ＰＮＧ载体；与Ｎ－糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为ｖｅｃｔｏｒ－ＰＮＧ－Ａ；ｖｅｃｔｏｒ－ＰＮＧ－Ａ载体经ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ酶切后回收小片段，插入经相同酶切的毕赤氏酵母表达载体，获得了带有Ｎ－糖酰胺酶和酵母性凝集因子Ｃ－末端基因的重组载体命名为ｐＰＩＣ９ｋ－ＰＮＧ－Ａ；（２）重组酵母菌株的构建：用ＳａｌＩ将重组载体ｐＰＩＣ９ｋ－ＰＮＧ－Ａ线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在ＭＤ平板上长出的菌落为阳性克隆；其中，ＭＤ平板培养基配方为：１３．４ｇ／Ｌ酵母基本氮源；０．４ｍｇ／Ｌ生物素；２０ｇ／Ｌ葡萄糖；（３）重组酵母菌株的培养与诱导：挑取上述阳性克隆单菌落，接种于ＹＰＤ培养基中，３０℃培养１２－２４小时，摇床转速为２４０－２７０转／分；当发酵液浓度达ＯＤ＝５－６时，按体积比１∶１００的接种量转接到ＢＭＧ培养基中培养，温度３０℃，摇床转速为２４０－２７０转／分；当发酵液浓度达ＯＤ＝１０－２０时，５０００ｇ离心５～１０分钟，收集菌体，用ＰＢＳ洗涤菌体１～２次，转接到ＢＭＭ液体培养基中，使发酵液浓度达ＯＤ＝０．５－１．０时，诱导培养，诱导温度２０℃～３０℃，摇床转速为１８０－２５０转／分，每隔１２小时向培养基中加入５～１０ｍｌ／Ｌ量的甲醇，培养２４－４８小时，５０００ｇ离心５～１０分钟，收集菌体，ＰＢＳ洗两次，即得固定化Ｎ－糖酰胺酶；其中ＰＢＳ为：ｐＨ６．０，１００ｍＭ磷酸盐缓冲液；其中ＹＰＤ培养基配方为：１０ｇ／Ｌ酵母粉；２０ｇ／Ｌ蛋白胨；２０ｇ／Ｌ葡萄糖。其中ＢＭＧ培养基配方为：ｐＨ６．０，１００ｍＭ磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源１３．４ｇ／Ｌ，生物素０．４ｍｇ／Ｌ，甘油１０ｍｌ／Ｌ；其中ＢＭＭ液体培养基配方为：ｐＨ６．０，１００ｍＭ磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源１３．４ｇ／Ｌ，生物素０．４ｍｇ／Ｌ，甲醇５ｍｌ／Ｌ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：祁庆生，苏移山，王鹏，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]