甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法，构建方法包括如下步骤：（１）酿酒酵母单倍体的获得及ＵＲＡ３基因的缺失；（２）ＰＵＣ１８－ＦＰＳ１－ＯＲＦ质粒的构建；（３）ＰＵＣ１８－ＦＵＦ质粒的构建；（４）ＫＡＭ－２１菌株的构建，本发明专利技术采用基因工程技术缺失编码镶嵌在细胞膜上的甘油通道蛋白ＦＰＳ１基因，丧失ＦＰＳ１基因的表达，由于细胞膜上没有甘油通道蛋白Ｆｐｓｌｐ，细胞内产生的甘油无法分泌到细胞外而在细胞内积累，甘油合成途径受到细胞内积累的甘油反馈抑制，甘油代谢向乙醇代谢转换，增加了乙醇产量，解决了乙醇生产成本高、发酵周期长、对环境污染严重等系列问题。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征包括如下步骤：（１）酿酒酵母单倍体的获得及ＵＲＡ３基因的缺失酿酒酵母子囊孢子的形成：取适量新活化的双倍体酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）细胞 均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，２６℃～３０℃培养２～３天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有５０μｌ无菌水的１．５ｍｌ离心管中，加入浓度为１０～２０ｍｇ／ｍｌ的蜗牛酶３～１０μｌ，３７℃消化子囊壁１０～３０ｍｉｎ；　　酿酒酵母子囊孢子的拆分：向上述离心管中缓缓加入１ｍｌ无菌水，倒置１～４ｍｉｎ，取３０～５０μｌ液体，滴到ＹＰＤ平板边缘上，倾斜平板使细胞液在平板边缘形成条形状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，直接将玻璃针尖上的子囊孢子摆放到ＹＰ Ｄ培养平板上，３０℃的条件下培养２～３天，将单个子囊孢子长出的菌落转接到ＹＰＤ液体试管中培养，培养７－８小时，收集菌体进行染色体提取、电泳进行单倍体验证，电泳图上仅出现一条５４４ｂｐ或４０ｂｐ电泳带，证明是单倍体，再经过发酵挑选优良的出发酵母菌株ＫＡＭ－１９；ＫＡＭ－１９菌株ＵＲＡ３基因的缺失：对质粒ＰＪＪ２４２中编码ＵＲＡ３基因的ＤＮＡ片段用ＮｃｏⅠ单酶消化，用Ｋｌｅｎｏｗ大片段补平，再用Ｔ４连接酶进行平末端连接，得到含有失活ＵＲＡ３片段的ＰＪＪ２４２质粒；用Ｈｉｎ ｄⅢ限制性内切酶把所述失活的ＵＲＡ３基因切下，采用醋酸锂方法将所述失活的ＵＲＡ３基因转化到酵母细胞ＫＡＭ－１９中进行基因重组，使ＫＡＭ－１９染色体上的ＵＲＡ３基因由质粒ＰＪＪ２４２上失活的ＵＲＡ３基因取代，将转化的酵母细胞涂在５－氟乳清酸平板上，凡是在该平板上生长出的酵母菌株为ＵＲＡ３缺陷型菌株－ＫＡＭ－２０；（２）ＰＵＣ１８－ＦＰＳ１－ＯＲＦ质粒的构建酵母染色体的制备：将双倍体酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌接种到含有５ｍｌＹＰＤ培养液的试管中，３０℃ 条件下振荡培养８－１０小时，然后将培养液倒入１．５ｍｌ离心管中，１２０００ｒｐｍ离心３０ｓｅｃ后，弃掉上清液，沉淀用０．５ｍｌ无菌水重悬，然后１２０００ｒｐｍ离心３０ｓｅｃ，收集菌体；往装有菌体离心管中加入２００μｌ破菌缓冲液重悬细胞，同时加入２００μｌ体积玻璃珠和２００μｌＰＨ＞７的苯酚或氯仿，振荡３～４ｍｉｎ；加２００μｌＴＥ缓冲液振荡，１２０００ｒｐｍ离心５...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马平生，张爱利，孔庆学，赵学明，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]