一种地衣芽孢杆菌菌株制造技术

本发明专利技术公开了一种地衣芽孢杆菌菌株，该地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株，保藏名称为：地衣芽孢杆菌ＺＪＵ１２，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：２００５年７月４日，保藏号：ＣＣＴＣＣ　　Ｍ２０５０７２。本发明专利技术还同时公开了该地衣芽孢杆菌菌株所产生的具有抗菌活性的细菌素，该细菌素对革兰氏阳性细菌、植物病原真菌、植物病原革兰氏阴性细菌具有拮抗作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种地衣芽孢杆菌菌株及其产生的细菌素在食品生物防腐保鲜、动植物病害防治和医药等方面的用途。
技术介绍
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一类自然界广泛存在的兼性厌氧腐生菌。长期以来该菌一直用作蛋白水解酶、淀粉酶、生物活性剂、抗生素及其他特殊化学物质等的工业生产菌，并且对人体健康和环境具有很低的毒性。地衣芽孢杆菌产生的肽类拮抗物质最早为Johnson等人于1945年从Bacillus subtilis var Tracy(1994年Meleney改名为Bacilluslicheniformis Var Tracy)菌株中分离到的一种环状多肽类拮抗物质，命名为杆菌肽(Bacitracin)，已经广泛应用于医药和兽药领域。该菌对多种革兰氏阳性细菌、部分革兰氏阴性细菌具有很好的拮抗作用。至今，人们已经从不同地衣芽孢杆菌中分离了一些肽类抗生素。这些肽类抗生素是二次代谢产物，不是基因编码的，并且对多种蛋白酶具有抗性。细菌素是一类由细菌分泌的，核糖体合成的，对相近细菌具有拮抗作用的蛋白质。最近，从不同的地衣芽孢杆菌菌株26 L-10/3RA、490/5和P40中分别分离到三种细菌素Lichenin、Bacillocin 490and P40。这些细菌素在分子量、热稳定性、培养条件、作用谱等方面不相同。但它们都不能对金葡萄球菌和真菌具有拮抗作用，并且对胰蛋白酶不敏感。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种地衣芽孢杆菌菌株，以及其产生的能对多种食品腐败菌、植物病原菌和人体病原菌具有拮抗作用的细菌素。本专利技术为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种地衣芽孢杆菌菌株，该地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株，保藏名称为地衣芽孢杆菌ZJU12，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2005年7月4日，保藏号CCTCC M 205072。此地衣芽孢杆菌ZJU12的菌种，在常温和常规培养基上长势良好；LB培养基上菌落呈灰白色，表面光滑，有粘性。本专利技术还提供了上述地衣芽孢杆菌菌株所产生的细菌素，此细菌素具有抗菌活性。此细菌素对革兰氏阳性细菌、植物病原真菌、植物病原革兰氏阴性细菌具有拮抗作用。革兰氏阳性细菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌或黄色微球菌等。植物病原真菌为白菜黑斑病菌、棉花枯萎病菌、石斛黑斑病原菌、水稻稻瘟病原菌或水稻纹枯病原菌等。植物病原革兰氏阴性细菌为水稻白叶枯病菌等。本专利技术所提供的拮抗细菌是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJU12 CCTCC M 205072，该菌分离自浙江大学华家池校区土壤。经实验证明，地衣芽孢杆菌ZJU12所产的细菌素在指数生长中期检测到，并且其活性在平稳生长前期达到最大值。地衣芽孢杆菌ZJU12的培养去菌液对枯草芽孢杆菌(Bacilliussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、黄色微球菌(Micrococcus flavus)等革兰氏阳性细菌，对白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、石斛黑斑病原菌(Guignardia sp)、水稻稻瘟病原菌(Pyricularia grisea Sacc.)和水稻纹枯病原菌(Rhizoctonia solani)等植物病原真菌均具有拮抗作用，但对大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和变形杆菌(Proteus sp)等革兰氏阴性细菌没有拮抗作用，但对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)这一植物病原革兰氏阴性细菌有较强拮抗作用。以黄色微球菌为指示菌，采用分步稀释法测定该培养去菌液的拮抗活力约为1000AU/ml。地衣芽孢杆菌ZJU12的培养去菌液经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后活性完全丧失。在100℃处理30分钟后拮抗活力无明显变化，在121℃处理15分钟后几乎没有活力。去菌液活性范围为pH3-11，并且最适pH值在7左右。地衣芽孢杆菌ZJU12的拮抗粗提物在0.8g/20g的剂量时实验老鼠没有急性毒性。因此可用于食品生物防腐保鲜、动植物病害防治和医药等方面。附图说明图1是地衣芽孢杆菌ZJU12生长曲线和细菌素产生曲线。具体实施例方式1、供试材料 1.1拮抗菌地衣芽孢杆菌ZJU12由本实验室分离自浙江大学华家池校区土壤，培养条件为LB液体或固体培养基(蛋白胨10g/L，NaC110g/L，酵母浸出物5g/L，固体再加琼脂15-20g/L，pH7.0)，30℃，需氧。1.2病原菌鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)，枯草芽孢杆菌(Bacilliussubtilis)，卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，粪肠球菌(Enterococcus faecium)，大肠杆菌(Escherichia coli)，黄色微球菌(Micrococcus flavus)，变形杆菌(Proteussp)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。培养条件为LB液体或固体培养基，30℃，需氧。白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)，水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)，稻瘟病原菌(Pyricularia grisea Sacc.)，棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)，水稻纹枯病原菌(Rhizoctonia solani)，石斛黑斑病原菌(Guignardia sp)，培养条件为PSA固体培养基(土豆200g/L，蔗糖10g/L，琼脂15-20g/L，pH7.0)，30℃，需氧。以上述病原菌作为指示菌。2、去菌液提取方法将地衣芽孢杆菌ZJU12接种于LB液体培养基中，30℃培养12小时作为种子培养液。接种5％到另一LB液体培养基中培养34小时。5000×g离心10分钟得到上清液为去菌液，作为拮抗液。3、细菌素拮抗活力的测定方法分别取上述指示菌接种于LB液体培养基中，培养过夜，取0.1ml菌液均匀布于LB平板上，风干后用孔径为5mm的打孔器打孔，每孔加20μl拮抗液，培养过夜，观察拮抗作用，此时的pH为7.0。具体结果见表1。表1 地衣芽孢杆菌ZJU12培养的去菌液的拮抗谱(pH 7.0) 注当抑菌圈直径为6-9mm时，拮抗能力表示为“+”；当抑菌圈直径为10-15mm时，拮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地衣芽孢杆菌菌株，其特征是：该地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株，保藏名称为：地衣芽孢杆菌ＺＪＵ１２，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：２００５年７月４日，保藏号：ＣＣＴＣＣＭ２０５０７２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何李黎，陈卫良，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]