本发明专利技术提供一种具有甘油－３－磷酸脱氢酶活性并与如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１表示的氨基酸序列具有８０％或更多同源性的多肽和一种具有甘油－３－磷酸磷酸酶活性并与如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２表示的氨基酸序列具有８０％或更多同源性的多肽。本发明专利技术还提供一种生产甘油的方法，所述方法包括：培养用包含多核苷酸的载体转化的宿主细胞，所述多核苷酸包括编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１表示的氨基酸序列的第一个多核苷酸和编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２表示的氨基酸序列的第二个多核苷酸，所述第一个多核苷酸和第二个多核苷酸与合适的调节序列可操作地连接；从培养物中回收甘油。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate)脱氢酶活性的多肽，具有甘油-3-磷酸磷酸酶的活性的多肽，编码所述多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及使用所述宿主细胞生产甘油的方法。
技术介绍
将甘油用作各种工业产品诸如化妆品、液体肥皂、食品、药、和润滑剂的中间体，并将其用作发酵工业的材料。例如，通过甘油的发酵生产1，3-丙二醇。可以通过发酵、化学合成，或脂解生产甘油。至于通过微生物发酵生产甘油，已知作为甘油生产微生物的酵母诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、C.magnoliae、P.farinose、和C.glycerinogenes，细菌诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，和藻类诸如D.tertiolecta。已知可以将通过操作已知甘油生物合成途径开发的重组微生物用作生产甘油的微生物。通常，在ATP存在的情况下，将碳底物诸如葡萄糖通过已糖激酶转变成葡萄糖-6-磷酸。通过葡萄糖-磷酸异构酶将葡萄糖-6-磷酸转变成果糖-6-磷酸，然后通过6-果糖磷酸激酶将其转变成果糖-1，6-二磷酸。通过醛缩酶将果糖-1，6-二磷酸转变成磷酸二羟丙酮(DHAP)。最终，通过NADH-依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)将DHAP转变成甘油-3-磷酸(G3P)，然后通过甘油-3-磷酸磷酸酶将其去磷酸化为甘油(Agarwal(1990)，Adv.Biochem.Engrg.41114)。此外，已经建议了从DHAP生产甘油的备选途径(Wang et al.，1994 J.Bact.1767091-7095)。按照甘油生产的备选途径，通过特异性或非特异性磷酸酶将DHAP去磷酸化为二羟丙酮，然后通过二羟丙酮还原酶将其还原为甘油。在原核生物和Schizosaccharomyces pombe中发现二羟丙酮还原酶。已经建议了从DHAP中生产甘油的另一备选途径(Redkar，ExperimentalMycology，19241，1995)。按照该生产甘油的备选途径，通过丙糖-3-磷酸异构酶将DHAP异构化为甘油醛-3-磷酸，所述丙糖-3-磷酸异构酶是常见糖酵解酶。将甘油醛-3-磷酸去磷酸化为甘油醛，然后通过醇脱氢酶或NADPH-依赖型甘油脱氢酶将其还原。在参与已知甘油生物合成途径的基因中，已知来自酿酒酵母的DARl和GPD1是编码将DHAP转变成G3P的G3PDH的基因。已知来自酿酒酵母的GPP2是编码将G3P转变成甘油的甘油-3-磷酸磷酸酶的基因。此外，已知使用重组宿主细胞生产甘油的方法，所述重组宿主细胞通过将涉及甘油合成的外源基因引入依赖于天然甘油合成途径的宿主细胞中而获得。例如，美国专利号6,358,716公开了从重组微生物中生产甘油的方法，其包括(i)用表达盒转化合适的宿主细胞，所述表达盒包括(a)编码NADH依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶或NADPH-依赖型甘油-3-磷酸脱氢酶的基因；和(b)编码甘油-3-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.21)的基因；(ii)在存在至少一个碳源的情况下，培养(i)的转化的宿主细胞，由此生产甘油，所述碳源选自由单糖、寡糖、多糖和单碳底物组成的组中；和(iii)回收(ii)中生产的甘油。附图简述附图说明图1举例说明了甘油-3-磷酸脱氢酶活性测量的结果。图2举例说明了甘油-3-磷酸磷酸酶活性测量的结果。图3举例说明了包含多核苷酸的载体的构建方案，其中将编码甘油-3-磷酸脱氢酶的多核苷酸和编码甘油-3-磷酸磷酸酶的多核苷酸可操作地与合适的调节序列进行连接。最佳方式本专利技术将在下文中通过实施例更具体地进行描述。然而，随后的实施例仅为举例说明而提供因此本专利技术不受限于它们，或被它们所限制。实施例1新基因的选择在该实施例中，使用由美国的国家生物技术信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information)(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的BLAST程序进行GPD1(NCBI X76859，SGDGPD1/YDL022W)和GPP2(SGDHOR2/YER062C)的同源性检索从而选择具有显著同源性但未知功能的基因，所述GPD1是催化将磷酸二羟丙酮(DHAP)转变成甘油3-磷酸的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因，所述GPP2是催化将G3P转变成甘油的来自酿酒酵母的甘油3-磷酸磷酸酶的基因。选定的基因是来自Candida albicans.的GPD2(SEQ ID NO3，CA0824)和RHR2(SEQ ID NO4，CA5788)。实施例2Candida albicans的GPD2和RHR2基因的亚克隆Candida albicans(KCTC7270)来自韩国生物科学和生物技术研究中心的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)并且从该菌株中提取了它的基因组DNA。使用基因组DNA作为模板和一对具有SEQ ID NOS5和6的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增GPD2。另外，使用基因组DNA作为模板和一对具有SEQ ID NOS7和8的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增RHR2。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，U.S.A.)将GPD2和RHR2的各自扩增产物克隆到pCR 2.1载体中从而分别构建pCR2.1-TOPO-GPD2和pCR2.1-TOPO-RHR2。实施例3将GPD2基因克隆到表达载体中1.GPD2基因的扩增使用在实施例2中构建的pCR2.1-TOPO-GPD2作为模板和一对具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增GPD2基因。所述具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列的引物包含NheI和XhoI的限制酶切位点。使用通过将Accur Power PCR Premix(Bioneer，Korea)和10ng的模板以及100pmol的每个引物(SEQ ID NOS9和10)混和在一起制备的20μlPCR溶液进行PCR。PCR条件如下于94℃变性30秒，于53℃杂交30秒，并于72℃聚合1分钟30秒，30个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的PCR产物。结果，发现扩增了1,129bp的DNA片段。分离和纯化后，使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，U.S.A.)将所述DNA片段克隆到pCR2.1载体上。2.将GPD2基因克隆到pSE380表达载体中用NheI和XhoI将上述部分1的包含扩增的PCR产物的pCR2.1载体进行消化从而生产GPD2基因，然后进行分离和纯化。同时，用NheI和XhoI对pSE380表达载体(Invitrogen，U.S.A.)进行消化，然后用CIP(牛小肠磷酸酶)进行处理。将1μl T4DNA连接酶和1μl连接酶缓冲液加入以前制备的100ngGPD2基因和10ng的pSE380载体限制片段中，并将蒸馏水加入其中以达到10μl的总体积并于16℃温育6小时。反应终止后，用得到的载体产物转化大肠杆菌(E.coli)D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，其具有甘油－３－磷酸脱氢酶活性并与如ＳＥＱＩＤＮＯ：１表示的氨基酸序列具有８０％或更多的同源性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴英薰，赵光命，严惠媛，
申请(专利权)人：CJ株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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