反馈抗性乙酰羟酸合成酶突变体制造技术

本发明专利技术提供了编码乙酰羟酸合成酶（ＡＨＡＳ）突变体的核苷酸序列，所述突变的酶及使用这些酶在特定的宿主中发酵生产支链氨基酸的方法，其中在宿主中表达编码修饰的乙酰羟酸合成酶（ＡＨＡＳ）的基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及特定的核酸和由该核酸编码的多肽及其应用。本专利技术的多肽可以通过发酵改进支链氨基酸的生产。具体地，本专利技术提供了用于编码乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthetase，AHAS)的突变体的核苷酸序列、突变体酶以及在特定的宿主中使用这些酶发酵生产支链氨基酸，在所述宿主中表达编码修饰的乙酰羟酸合成酶(AHAS)的基因。众所周知氨基酸可以通过棒状细菌菌株发酵来生产，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。由于此种生产方法具有重大意义，人们不断地进行研究以改进其生产方法。对该方法的改进涉及有关发酵技术的方法，例如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的组成，如发酵过程中的糖浓度，或者涉及产物的纯化，例如通过离子交换层析，或者涉及微生物本身的固有工作特性。这些微生物的工作特性通过使用诱变、选择和突变体选择的方法得以改进。这样，得到的菌株对抗代谢物具有抗性，所述抗代谢物包括异亮氨酸类似物异亮氨酸氧肟酸盐(isoleucine hydroxyamate)(Kisumi M，Komatsubara S，Sugiura，M，Chibata I(1972)Journal ofBacteriology 110761-763)、缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸(Tsuchida T，Yoshinanga F，Kubota K，Momose H(1975)Agricultural and BiologicalChemistry，Japan 391319-1322)或亮氨酸类似物α-氨基丁酸盐(Ambe-Ono Y，Sato K，Totsuka K，Yoshihara Y，Nakamori S(1996)Bioscience Biotechnology Biochemistry 601386-1387)；或者菌株对具有重要调节功能的代谢物是营养缺陷型的，并且产生诸如支链氨基酸(Tsuchida T，Yoshinaga F，Kubota K，Momose H，Okumura S(1975)Agricultural and Biological Chemistry；Nakayama K，Kitada S，KinoshitaS(1961)Journal of General and Applied Microbiology，Japan 752-69；Nakayama K，Kitada S，Sato Z，Kinoshita(191)Journal of General andApplied Microbiology，Japan 741-51)。近年来，重组DNA技术的方法也被用于合成支链氨基酸的棒状细菌菌株的菌株改良，主要通过扩增支链氨基酸的各个生物合成基因并研究对于支链氨基酸生产的影响来进行。Kinoshita(“Glutamic AcidBacteria”，inBiology of Industrial Microorganisms，Demain andSolomon(Eds.)，Benjamin Cummings，London，UK，1985，115-142)、Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))、Eggeling(Amino Acids 6261-272(1994))、Jetten和Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15，73-103(1995))、Sahm et al.(Annuals of the New York Academy ofScience 782，25-39(1996))及Eggeling等(Journal of Biotechnology 56168-180(1997))等作者都对此类研究作过综述。支链氨基酸比如L-异亮氨酸、L-缬氨酸及L-亮氨酸在医药工业、人类医学和动物营养方面都有应用。细菌中合成所有三种氨基酸的一个关键酶就是乙酰羟酸合成酶(AHAS)。其催化两个反应，产生这三种氨基酸的前体。在缬氨酸和亮氨酸的生物合成途径中，AHAS的底物是丙酮酸。AHAS催化丙酮酸脱羧并与另一个丙酮酸分子缩合产生乙酰乳酸。在异亮氨酸途径中，AHAS催化丙酮酸与2-酮丁酸反应，产生乙酰羟丁酸。在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中存在多达三种AHAS同工酶。所述同工酶的活性被一组氨基酸抑制，其中缬氨酸的抑制最为强烈(De Felice，M.，Levinthal，M.，Iaccarino，M.，Guardiola，J.，1979.Growth inhibition as a consequence of antagonism between related aminoacidseffect of valine in Escherichia coli K12.Microbiol Rev 43，4258)。AHAS I由ilvBN基因编码，可被缬氨酸和异亮氨酸抑制；AHAS II由ilvGM编码，是缬氨酸抗性的；AHAS III由ilvIH编码，可被缬氨酸和异亮氨酸抑制。在所有情况下，该酶都由两个亚基组成。在AHASI和AHAS III中，抑制作用是由分别被ilvN和ilvH基因编码的小调节亚基所介导的。与大肠杆菌不同，在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中，唯一的AHAS由ilvBN编码(Keilhauer，C.，Eggeling，L.，Sahm，H.，1993.Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicummolecular analysisof the ilvB-ilvN-ilvC operon.J.Bacteriol.175，5595-5603)。谷氨酸棒杆菌酶的活性也被缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸抑制(Eggeling，I.，Cordes，C.，Eggeling，L.，Sahm，H.，1987.Regulation of acetohydroxy acidsynthetase in Corynebacterium glutamicum during fermentation ofalfa-ketobutyrate to L-isoleucine.Appl Microbiol Biotechnol 25，346-351)。这三种氨基酸还通过转录弱化来调节ilvBNC基因簇的表达(Morbach，S.，Junger，C.，Sahm，H.，Eggeling，L.，2000.Attenuationcontrol of ilvBNC in Corynebacterium glutamicumevidence of leaderpeptide formation without the presence of a ribosome binding site.JBiosci Bioeng 90，501-507)。在谷氨酸棒杆菌中，到目前为止，还没有报道在分子水平去调节(deregulating)AHAS活性的突变。本专利技术的目的在于提供一种修饰的乙酰羟酸合成酶(AHAS)。具体地，本专利技术的AHAS更倾向于不被以上产生的几本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核酸序列，其编码具有乙酰羟酸合成酶（ＡＨＡＳ）活性的多肽，所述核酸序列选自以下一组：ａ）ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：１或ＳＥＱ．ＩＤＮｏ：３的核酸序列；ｂ）包含编码分别位于第２１位和第２２位的Ａｓｐ和Ｐｈｅ的碱基三联体的 核酸序列；ｃ）在严格条件下与ａ）或ｂ）的序列杂交的核酸序列；ｄ）与ａ）或ｂ）的序列具有至少７０％的同源性的核酸序列；ｅ）编码与ａ）或ｂ）的序列所编码的多肽在氨基酸水平上具有至少８０％同源性的多肽的核酸；ｆ）编 码与ａ）或ｂ）的序列所编码的多肽相比具有改良的活性和／或选择性和／或稳定性的多肽的核酸，该核酸如下制备：ｉ）诱变ａ）或ｂ）的核酸，ｉｉ）将可由ｉ）得到的核酸序列连接入合适的载体，再转化入合适的表达系统，及ｉｉｉ）表达 并检测具有改良的活性和／或选择性和／或稳定性的所需多肽；ｇ）含有ａ）－ｆ）的核苷酸序列中的至少１５个连续碱基的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：米罗斯拉夫帕特克，维罗尼卡埃利沙科娃，
申请(专利权)人：德古萨股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]