可高产糖肽复合物的灵芝真菌及其诱变选育方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌，及其诱变选育方法和用途。该灵芝真菌其分类命名为：灵芝真菌Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　　Ｌｕｃｉｄｕｍ，于２００４年１１月２２日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１２５１。其诱变选育步骤包括：以购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，菌种保藏号为ＣＧＭＣＣ　　５．５３３的灵芝真菌ＣＡＵ５５作为出发菌株，依次于固体培养基、液体培养基上培养，得到出发菌株ＣＡＵ５５菌丝体液；将此菌丝体液酶解、过滤，得到出发菌株ＣＡＵ５５原生质体沉淀；再将此原生质体进行紫外诱变和再生培养，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌ＣＡＵ５５０１。该可高产糖肽复合物的灵芝真菌可用于液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂，或用于制备益生素、免疫增强剂等微生制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说是涉及一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌，及其诱变选育方法和用途。
技术介绍
由于多年来在动物饲养和饲料中广泛和长期使用抗生素、化学合成药物、激素等促生长保健剂，导致畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细菌耐药性增强、耐药菌株增多，因而极大的威胁着人类健康和生态环境。由于抗生素的上述诸多副作用，和近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色饲料添加剂，以减少或替代抗生素等药物添加剂。灵芝和灵芝糖肽复合物因其独特的理化特性和神奇的生物学功能而成为新型绿色饲料添加剂领域的研究热点。灵芝真菌的生长是孢子→菌丝体→子实体的过程。由于灵芝人工栽培生长周期过长(大于2-3个月)，且灵芝子实体糖肽复合物提取工序复杂，因此成本过高，难以满足大规模工业生产的需要，从而限制了其在畜牧业中的应用；另一方面，研究发现，同种(株)灵芝真菌的菌丝体与子实体的糖肽复合物的分子量、组成、结构、比例、化学性质及生物学活性相似，因此采用生物发酵方法直接培养灵芝真菌丝体，再分别提取胞内、胞外糖肽复合物具有许多优点。与前者相比，生物发酵法只将灵芝真菌培养到菌丝体阶段，且其糖肽复合物后提取工序简单，生产周期缩短，生产效率得以提高。在生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的主要因素有三个生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。从自然界分离出的菌种，由于生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，菌体趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业的期望或需要与此相反，需要微生物的代谢产物，如多糖或其它活性成分等，能够大量积累。为此，采用种种方法来打破菌种的正常代谢，使之失去自我保守性的调节控制，从而大量积累我们所需要的目标代谢产物，如灵芝糖肽复合物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术制备灵芝糖肽复合物饲料添加剂的成本高而不易于在动物养殖行业推广使用的缺陷，通过原生质体紫外诱变技术选育一株可高产糖肽复合物的灵芝真菌，使其能经发酵生产出在饲料中添加量低、功能明确，具有提高动物体免疫力、抗病力，促进免疫系统生长发育，提高其奶、肉、蛋产量和生产能力，改善奶、肉、蛋的品质和风味，提高水产动物的生长速度和存活率，能广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品等优点的灵芝糖肽复合物饲料添加剂。本专利技术的另一目的在于提供一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌的诱变选育方法。本专利技术的再一目的在于该可高产糖肽复合物的灵芝真菌用于液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂或免疫强化饲料添加剂等的应用。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的本专利技术提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌，其分类命名为灵芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1251。该灵芝真菌菌丝生长速度快，菌丝体为纯白色，产孢子；需避光培养，其培养需Mg2+、K+等微量元素及B族维生素；高产糖肽复合物等生物活性物质。本专利技术提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌的诱变选育方法，其诱变选育步骤如下1)出发菌株CAU55菌丝体的培养以本实验室于4℃保存，购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，菌种保藏号为CGMCC 5.533的灵芝真菌CAU55作为出发菌株；将出发菌株CAU55接种于灭菌固体培养基上，25～30℃固体培养5～10天；将培养好的菌株接种于灭菌液体培养基中，28～32℃摇瓶培养3～5天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基中，28～32℃摇瓶发酵培养3～5天，得到出发菌株CAU55菌丝体液，备用；所述的固体培养基为按下述比例配制的马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O0.75～2.5g，琼脂15～20g；所述的液体培养基为按下述比例配制的葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH2PO40.5～2g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，蒸馏水1000ml； 2)出发菌株CAU55原生质体的制备酶解将步骤1)中培养的出发菌株CAU55菌丝体液于2000～4000r/min离心1～3min；去上清，加灭菌渗透压稳定剂1～3ml，轻微振荡后2000～4000r/min离心1～3min，此步骤重复操作2～3次；去上清后，按酶解液(ml)菌丝体重(g)1～4∶1的比例，在菌丝体沉淀中加入滤菌后的酶解液，充分振荡，25～30℃培养1～3小时，备用；过滤将酶解好的菌丝体液过滤，再用少量渗透压稳定剂冲洗滤膜，1000～3000r/min离心1～5min，得到出发菌株CAU55原生质体沉淀；所述渗透压稳定剂为按下述比例配制的80～130g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，灭菌备用；3)原生质体的紫外诱变和再生培养将步骤2)所得出发菌株CAU55原生质体沉淀制成悬浮液，并调至原生质体个数为104～106个/ml，液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为15～18W，照射时间为0.5～5min，照射距离25～30cm；照射后立即稀释涂布在原生质体再生培养基上，27～32℃培养6～10天，进行初筛，挑选10～40个菌丝体生长速度较快的单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用苯酚-硫酸法测定其糖肽复合物含量，选择6～10株糖肽复合物高产菌株CAU550N，再分别做传代稳定性实验，选出一株菌丝生长速度最快，糖肽复合物产量最高且稳定性好的菌株CAU5501；所述原生质体再生培养基为按下述比例配制的D-纤维二糖10～15g，蛋白胨2～3.5g，酵母浸粉1.5～4g，KH2PO42～3g，MgSO4·7H2O 1.0～2.5g，VB120～50μg，渗透压稳定剂1000ml；所述传代稳定性实验的步骤是将选出的6～10株糖肽复合物高产菌株CAU550N，分别接种到灭菌固体培养基上，25～30℃固体培养5～8天，培养好后再接种到灭菌固体培养基上，25～30℃固体培养5～8天，重复此步骤5～10次，观察CAU550N的生长速度；将已传种5～10代的CAU550N接种到液体培养基中，28～32℃摇瓶培养3～5天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基中，进行摇瓶发酵，28～32℃培养3～5天，得菌丝体液，分别测定它们的糖肽复合物产量，剔除菌种退化，生长速度下降或生产性能下降的菌株，保留生长速度快，生产性能优良、稳定的菌株，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501，其分类命名为灵芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No.1251。本专利技术提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌的诱变选育方法，还包括将得到的高产菌株CAU5501保存在固体培养基II上，4℃保藏，每3个月转接一次。转接用于该菌株的正常传代，以防止菌株退化。所述固体培养基II为按下述比例配制的马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH2PO41.5～3g，MgSO4·7H2O0.75～2.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌，其分类命名为：灵芝真菌ＧａｎｏｄｅｒｍａＬｕｃｉｄｕｍ，于２００４年１１月２２日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．１２５１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张日俊，鉏晓艳，王铮，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]