本发明专利技术公开了一种生产乙肝和丙肝病毒ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ２疫苗的酵母菌株及制备方法。本发明专利技术提供的酵母菌株Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＳＭＤ１１６８／ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ２，ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０６０６９，基因组中含有乙型、丙型肝炎病毒的ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ１融合基因。酵母菌株Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＳＭＤ１１６８／ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ２经过诱导，可以分泌表达ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ２融合蛋白，表达量可以达到２０ｍｇ／Ｌ。该融合蛋白兼具乙肝病毒和丙肝病毒两种抗原性质，免疫家兔后可以产生抗ＰｒｅＳ、抗Ｅ１和抗Ｅ２的抗体，并且免疫原性良好，作为疫苗能可望同时预防乙肝和丙肝这两种病毒性疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，具体涉及一种酵母工程菌株，同时涉及工程菌株的制备方法。该菌株可以产生乙型、丙型肝炎病毒的PreS-E1-E2融合抗原，用该抗原作疫苗免疫试验动物能诱导动物同时产生抗乙肝病毒和抗丙肝病毒抗体，能有效预防乙型和丙型肝炎。
技术介绍
病毒性肝炎(viral hepatitis)是世界上流行广泛、危害极大的传染病，其中以乙型肝炎(hepatitis B)和丙型肝炎(hepatitis C)危害最大，它们均可转变成慢性持续性感染，并进一步导致肝坏死、肝硬化和肝癌。目前对乙肝和丙肝均无特别有效的治疗药物和治疗手段，因此对这两种疾病的预防具有重要意义。国内外都在积极开展乙肝和丙肝疫苗的研究和开发，目前国内外已有第二代乙型肝炎疫苗用于预防乙型肝炎，而丙型肝炎还没有疫苗产品。第一代乙肝疫苗为血源疫苗，来源于乙肝病人血清中的22nm的粒子，这种粒子不含乙肝病毒DNA，只含表面抗原和脂质，具有很强的免疫原性，免疫效果也最好；但血源疫苗受到来源、安全性等限制，难以满足普遍接种的需要，而且更重要的是产品容易受到血清中存在的各种病毒如艾滋病、丙肝病毒等污染，目前国内已经禁止使用血源来源的乙肝疫苗。第二代乙肝疫苗为基因工程蛋白疫苗，是用酵母或哺乳动物细胞表达的乙肝病毒表面抗原主蛋白(HBsAg，S蛋白)。S蛋白疫苗在预防乙肝传播方面发挥了重要作用，但仍有不足，在免疫试验区仍有少数免疫过的儿童感染乙肝，大约有10-20％的接种人群对S蛋白疫苗无反应或低反应，不能产生足够的保护作用。因此，进一步提高疫苗的免疫原性和加强免疫保护性非常必要。目前国内外正在积极进行第三代乙肝疫苗的研究开发，主要目标是乙型肝炎病毒的大表面抗原(LP)，即全长的PreS抗原(PreS1+PreS2+S)。目前已有研究证实PreS蛋白可以获得比S蛋白更为全面和持久的免疫效果。乙型肝炎基因组的S区有3-4个翻译起始点，分别编码表面抗原主蛋白(S蛋白)、中蛋白(MP蛋白)和大蛋白(LP，全长PreS蛋白)，S蛋白是其中最小的蛋白，中蛋白MP为S蛋白N端加上55aa的PreS2，大蛋白PreS为中蛋白N端加上108aa的PreS1。S蛋白是乙肝病毒外壳和22nm表面抗原颗粒的主要成分，占70-80％。MP和LP(PreS蛋白)主要存在于乙肝病毒颗粒中，并暴露于颗粒表面。三种蛋白均具有很强的免疫原性。近年的研究表明，PreS蛋白虽然在HBV粒子中的含量很少，远不及S蛋白，但具有非常强的免疫原性，PreS蛋白的N端，即PreS1部分，是暴露于病毒颗粒表面的，具有极强的免疫原性，有文献报道，单独使用PreS1肽段即能起免疫保护作用。J.Le.Seyee等人(1999)证实PreS1的第3-77aa影响乙型肝炎的感染力。PreS1还参与乙肝吸附和进入细胞过程，还可能与病毒装配和分泌有关，大量研究结果已经证实PreS1区24-47位氨基酸与肝细胞受体结合，用含这段氨基酸序列的合成肽段免疫黑猩猩，即能产生中和抗体，起到完全的保护作用。PreS2蛋白的C端与S蛋白相连形成MP，PreS2也是暴露于HBV囊膜外层的，其上具有多聚人血清白蛋白(Polymenized HumanSerum Albumin，PHSA)的受体(PHSA-R)，能与PHSA结合。由于肝细胞表面也有PHSA-R，HBV能通过血循环中存在的PHSA的介导，吸附到肝细胞表面。PreS2有良好的免疫原性，能刺激机体产生相应抗体-抗PreS2。此抗体出现于急性感染恢复早期，比抗S抗体出现早而维持时间与抗S抗体一样。抗PreS2亦具有中和作用，可作为机体康复的指标之一。PreS蛋白实际上是PreS1+PreS2+S蛋白，理论上集中PreS1，PreS2和S蛋白的免疫原性，大量的研究结果亦表明PreS蛋白的免疫原性和免疫保护性比S蛋白强。目前，PreS疫苗还处于研究阶段，国际上还没有产品进入市场。丙型肝炎病毒从上世纪90年代初开始大量研究。由于丙型肝炎基因的易变性，加上没有实用的动物模型以及长期缺乏有效的细胞系统，至今在国内外还没有丙肝疫苗产品。不过，近年来的研究表明HCV疫苗开发具有可行性，主要目标还是HCV的包膜蛋白E1和E2。其中，E2负责与细胞表面受体结合而使HCV病毒附着细胞表面，而E1参与细胞膜溶解和病毒进入细胞过程。最近通过对E2蛋白的研究，表明E2蛋白作为HCV工程蛋白疫苗非常有前途，这些新发现主要有以下几个方面(1)E2蛋白的高变区1(HVR1)缺失的突变株接种黑猩猩仍然可造成急性和慢性感染，证实HVR1起码是感染非必需的，其缺失不影响E2的构象，也不影响E2与受体的结合。(2)E2蛋白HVR1区的变异不是随机的，不同株的HVR1的一些氨基酸是保守的，HVR1的构象和电荷是一样的。(3)E2蛋白的614-622aa区和489-498aa区是CTL表位，可以很好地诱导CTL反应，这两个区域是在保守区内的。(4)CD81已经公认是肝细胞表面的丙肝病毒受体之一，E2蛋白的480-493aa区和544-551aa区可以与CD81结合，参与病毒-细胞间的吸附过程，这些区域是相对保守的，针对这两段的抗体具有中和性。(5)用HCV1a型病毒缺损的RNA基因组免疫黑猩猩，能产生交叉保护，可使黑猩猩抵抗HCV1a和1b型病毒攻击。同时，针对E1蛋白的研究结果也令人鼓舞，作为负责病毒-细胞融合和病毒进入的蛋白，E1蛋白也存在两个抗原性很强的抗原表位(210-223aa区和288-329aa区)，同时，在部分自动康复病人发现具有较高水平的E1抗体，但在慢性丙肝病人中Core、NS3抗体的水平高，而E1的水平低，表明E1抗体极有可能具有保护性。因此，在研究HCV工程蛋白疫苗时，应当将E2蛋白和E1蛋白结合起来考虑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产乙型肝炎病毒PreS蛋白和丙型肝炎病毒E1-E2蛋白的融合抗原PreS-E1-E2疫苗的酵母工程菌株。该工程菌株可以生产PreS-E1-E2融合抗原，用该抗原作疫苗免疫试验动物能诱导动物同时产生抗乙肝病毒和抗丙肝病毒抗体，能有效预防乙型和丙型肝炎。融合蛋白中的PreS蛋白包含PreS1、PreS2和S三个区域，与乙型肝炎现有的S疫苗(主要成分为HBsAg)相比，PreS蛋白含有更多的抗原表位，PreS2中120-145位氨基酸还含有能中和病毒的抗原决定簇，并且PreS1(21-47位氨基酸)是病毒与肝细胞受体的结合位点，因此PreS蛋白比S蛋白具有更强的免疫原性；为了融合蛋白在酵母菌株中顺利表达，融合蛋白中的HCV E1蛋白缺失C末端43aa的高疏水区域，E2蛋白缺失C末端53aa的高疏水区域，该融合蛋白仍保留了HCV E1和E2的重要抗原表位编码区。本专利技术的另一个目的在于制备肝炎病毒的Pres-E1-E2融合抗原的酵母工程菌株的方法，方法简便，易于分离纯化，适用于工业化大生产。本专利技术是在多年研究HBV PreS基因和HCV E1、E2基因的基础上，把HBV的PreS蛋白和HCV的E1、E2蛋白进行融合表达，构建PreS-E1-E2融合基因克隆。此融合基因同时含有HBV和HCV的重要抗原表位的编码区，表达的基因工程蛋白可同时诱导机体产生抗HB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ蛋白和丙型肝炎病毒Ｅ１－Ｅ２蛋白的融合抗原ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ２疫苗的酵母工程菌株，其特征在于：巴斯德毕赤酵母菌株ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＳＭＤ１１６８／ＰｒｅＳ－Ｅ１－Ｅ２，ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０ ６０６９。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶林柏，吴正辉，佘应龙，叶力，郜金荣，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。