维生素C的微生物生产方法技术

本发明专利技术提供了一种从底物，例如Ｌ－山梨糖酮，来生产维生素Ｃ的方法，其中使用属于Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ属的微生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对L-抗坏血酸(维生素C)进行的微生物生产。维生素C对人来说是非常重要且不可缺少的营养因子之一，通过所谓的“Reichstein方法”已能对其进行商业生产，该方法作为技术上成熟的方法已被人们所熟知。但是该方法包含大量复杂的步骤，并且难于获得总产量的任何提高。因此，已有大量建议，企图用于减少步骤数量和/或提高总产量。本专利技术提供了一种生产维生素C的方法，所述方法包括在培养基中，使用属于Ketogulonicigenium属的微生物将底物转化为维生素C。底物到维生素C的转化指，导致产生维生素C的底物转化是通过属于Ketogulonicigenium属的微生物来进行的，即，底物可被直接转化为维生素C。在允许上文定义的此类底物转化进行的条件下，对所述微生物进行培养，例如，将微生物与底物直接接触。还可以使用例如静止细胞、丙酮处理过的细胞、被冻干的细胞、被固定的细胞等形式的微生物，以在底物上直接发挥作用。通过使用通气，可使用本身已知能作为用于微生物的培养技术的方法的任何手段，优选地，搅拌深浸式发酵罐。进行反应的优选细胞浓度范围为每ml大约10mg至大约700mg湿细胞，更优选地，每ml大约30mg至大约500mg湿细胞。本文中使用的培养基可以是用于生产维生素C的任何合适的培养基。典型地，该培养基是水性培养基，其中包含，例如，盐、底物并且具有一定的pH。碳源可以作为底物使用，例如D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、L-葡萄糖或L-古洛糖-γ-内酯。优选地，底物选自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更优选地，L-山梨糖酮。属于Ketogulonicigenium属的合适的微生物可以例如，选自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其能够进行本专利技术的底物到维生素C转化的突变体。在本专利技术的一个方面，属于Ketogulonicigenium属的微生物选自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其突变体，但排除Ketogulonicigenium vulgareDSM 4025或其突变体。在一种实施方式中，本专利技术提供了从L-山梨糖酮生产维生素C的方法，所述方法包括将选自Ketogulonicigenium robustum、Ketogulonicigenium vulgare或其突变体的微生物与L-山梨糖酮在反应混合物中接触，以及从反应混合物中对维生素C进行分离和纯化。应当理解，“Ketogulonicigenium robustum”和“Ketogulonicigeniumvulgare”还包括上述物种的具有同样的生理属性的异名(synonym)或基源异名(basonym)，如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义的。在本文中，上文提到的微生物的“突变体”指其基因组序列发生了改变的、但仍能进行本专利技术的方法所提供的从底物(例如，L-山梨糖酮)到维生素C的转化的微生物。可以通过任何传统方法来获得突变体，包括，例如，化学和UV诱变接着针对目标表型进行筛选或选择，体外构建功能缺陷基因，这可以通过下述方法来进行，所述方法包括用于对微生物基因组中完整基因段进行替换的重组技术，单双交叉重组以及其它已知技术。见，Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Harwood and Cutting，Molecular Biology Methods For Bacillus，John Wiley and Sons(1990)，pp.27-74。合适的诱变剂包括但不限于，紫外射线、X-射线、γ-射线和化学诱变剂，例如，氮芥或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍。此外，可以通过本身为本领域技术人员所熟知的用于此目的的任何方法，对通过自发突变产生的克隆进行分离来获得突变体。在一种优选的实施方式中，用于本专利技术方法的微生物选自由K.robustum NRRL B-21627、K.vulgare NRRL B-30035、K.vulgare NRRL B-30036、1. vulgare NRRL B-30037N及其各自的突变体所构成的组。K.robustum NRRL B-21627被描述于US 5,834,231中。菌株K.vulgareNRRL B-30035、K.vulgare NRRL B-30036和K.vulgare NRRL B-30037N被描述于US 6,316,231 B1中。公众可从Agricultural Research CultureCollection(NRRL)，1815N.University Street，Peoria，Illinois 61604，USA获得这些菌株。在一种实施方式中，本专利技术提供了从L-山梨糖酮生产维生素C的方法，所述方法包括将属于Ketogulonicigenium属的微生物与L-山梨糖酮在反应混合物中接触，以及从反应混合物中对维生素C进行分离和纯化。本文中使用的“将微生物与L-山梨糖酮在反应混合物中接触”包括在含有L-山梨糖酮的培养基中培养微生物。还可以使用例如静止细胞、丙酮处理过的细胞、被冻干的细胞、被固定的细胞等形式的微生物，以在底物(即L-山梨糖酮)上直接发挥作用。通过使用通气，可使用本身已知能作为与用于微生物的培养技术相关的方法的任何手段，优选地，搅拌深浸式发酵罐。开展反应的优选细胞浓度范围为每ml大约10mg至大约700mg湿细胞，更优选地，每ml大约30mg至大约500mg湿细胞。合适的“反应混合物”可以是水或本领域内已知用于培养微生物的任何营养培养基。此类营养培养基包括碳源、氮源和其它无机盐，其可被微生物所利用。通常用于使微生物更好地生长的多种营养物质可能被适当地包括进培养基。此类营养物的例子，例如可吸收的碳源包括但不限于，甘油、D-甘露醇、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、卫矛醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖。可消化的氮源，例如有机物质，包括但不限于，蛋白胨、酵母提取物、烘焙酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液。多种无机物质也可作为氮源使用，例如硝酸盐和铵盐。此外，培养基通常含有无机盐，例如，硫酸镁、磷酸钾和碳酸钙。对本专利技术微生物的培养可在大约4.0至大约9.0的pH下进行，其中，可以优选保持为大约5.0至大约8.0的pH。培养期随pH、温度和所用的营养培养基而变化，其优选为大约1至5天，最优选为大约1至3天。优选用于开展本专利技术方法的温度是大约13至大约36℃之间的温度，更优选的是大约18至大约33℃之间的温度。虽然底物例如L-山梨糖酮的浓度可以随反应条件变化，但是反应优选在底物浓度为大约2至大约120mg/ml的条件下进行，更优选地，浓度为大约4至大约100mg/ml。在一种实施方式中，本专利技术的方法在L-山梨糖酮浓度为大约2至大约120mg/ml的条件下进行，更优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产维生素Ｃ的方法，所述方法包括：在培养基中，用属于Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｃｉｇｅｎｉｕｍ属的微生物将底物转化为维生素Ｃ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：星野龙男，杉泽辉秀，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]