本发明专利技术提供了一种重组豌豆白蛋白亚组分ＰＡ１ｂ基因的异源表达方法，该方法包括：目的基因ＰＡ１ｂ的合成：重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ转化宿主菌大肠杆菌；转化宿主菌毕赤酵母菌ＧＳ１１５，构建表达ＰＡ１ｂ的基因工程菌；ＰＡ１ｂ基因工程菌的发酵培养。本发明专利技术采用ＤＮＡ体外重组的方法，构建出了能够表达ＰＡ１ｂ的基因工程菌，实现了ＰＡ１ｂ基因的异源表达，通过液体深层发酵密集培养的方式来批量获得目的产物，首次实现了植物活性多肽豌豆ＰＡ１ｂ资源的规模化生产。本发明专利技术工艺简便，成本低，产量高，重组蛋白获得率约为２０ｍｇ／Ｌ。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种重组豌豆白蛋白亚组分ＰＡ１ｂ基因的异源表达方法，其特征在于包括如下步骤：（１）目的基因ＰＡ１ｂ的合成；双酶切ＰＡ１ｂ基因与载体，构建重组的表达载体；以豌豆ｃＤＮＡ文库为模板，以上游引物、下游引物进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得ＰＡ１ｂ基因片段；扩增ＰＡ１ｂ基因片段用Ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ纯化，并用内切酶ＸｈｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切，酶切片段经纯化后，通过连接酶连接入ｐＰＩＣＺαＡ载体上，构建表达产物的重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ；所述上游引物ＸｈｏⅠ－ＰＡ－Ｆ：５′－ＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＧＧＴＧＴＴＴＧ－３′；所述下游引物ＮｏｔⅠ－ＰＡ－Ｒ：５′－ＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ－３′；（２）重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ转化宿主菌大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０；步骤（１）获得的重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ采用电转化的方式导入大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０中，菌体在含抗生素Ｚｅｏｃｉｎ的ＬＢ培养基平板上培养，筛选转化菌；再将阳性转化菌株接种到含抗生素Ｚｅｏｃｉｎ的ＬＢ液体培养基中，进行扩大培养；过夜后离心收集细胞，提取重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ；（３）重组质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ转化宿主菌毕赤酵母菌ＧＳ１１５，构建表达ＰＡ１ｂ的基因工程菌：将步骤（２）获得的表达重组蛋白基因的质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＰＡ１ｂ先用ＳａｌⅠ处理成线状后，采用电转化的方法将其导入毕赤酵母细胞；然后涂布在含抗生素Ｚｅｏｃｉｎ的ＹＰＤ培养基中，涂布量分别为１０～２００μｌ；或者采用快速直接筛选多拷贝数的重组体的方法将转化子涂布在高Ｚｅｏｃｉｎ含量的ＹＰＤ培养基中，筛选转化菌；（４）ＰＡ１ｂ基因工程菌的发酵培养：第一步，富集菌体：从步骤（３）获得的Ｚｅｏｃｉｎ抗性菌落接种到ＭＧＹＨ培养基中，在２５～３０℃下，振动培养至Ａ↓［６００］为２．６；室温下，发酵液低速离心移去上清液，收集细胞；第二步，诱导重组蛋白表达：将上一步收集的细胞用ＢＭＭＨ培养基重新悬浮细胞至Ａ↓［６００］为０．１，进行培养，诱导抗虫蛋白表达；每２４ｈ添加１００％甲醇至终浓度为０．５％，维持诱导压力，促使重组蛋白表达；（５）表达产物的分离纯化：经甲醇诱导重组蛋白表达的发酵液离心除去细胞后，上清液采用Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５超滤膜分离；滤液进一步用ＨＰＬＣ分离，收集组分真空冷冻干燥，得到异源表达生产的豌...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，许喜林，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[]
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