埃博霉素Ｂ的制备方法技术

本发明专利技术涉及埃博霉素Ｂ的制备方法。具体的说，本发明专利技术提供了一种采用１００升～５００升发酵罐大规模发酵和大量分离制备埃博霉素Ｂ的技术方法。本发明专利技术还涉及埃博霉素Ｂ的制剂及在制备治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于制药
，具体的说，涉及埃博霉素B的制备方法、制剂工艺及其制备 治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物的用途。
技术介绍
埃博霉素为上个世纪八十年代末GBF的微生物学家发现的粘细菌纤维堆囊菌Sorangium Cellulosum产生的次级代谢产物。1987年分离出两种新的大环内酯物命名为埃博霉素A和B, 实验发现对培养的真菌病原体有抑制活性。1994年美国国家癌症学会发现埃博霉素B对肿瘤细 胞具有抑制活性，Merck实验室发现它和紫杉醇至少在微管蛋白聚合实验中有相同作用，证明 了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的事实。进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶 性好,结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素 活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒 性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有 更大的抗增殖活性，而埃博霉素A往往比紫杉醇的活性更低。另外，埃博霉素对一株多药耐药 性直肠癌系和紫杉醇抗性卵巢癌系仍然具有敏感性。目前埃博霉素有几种同类物质已经进入 临床研究阶段。主要包括Epothilone B (EP0 B)， Epothilone D及BMS-247550。在对300个病 人的初步临床实验中，该化合物对结肠癌、乳腺癌、肾脏和卵巢癌，有确切的疗效。0 OH 0R尸Me R2=H 印othilone A RfMe R2=Me epothilone B目前公开发表的通过发酵制备埃博霉素B方法生产成本高，尚需研究大规模和简单廉价 的发酵制备技术和分离纯化方法。慢性髓细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是血液系统最常见的恶性疾病之 一,在国内年发病率约为0.36/10万，占白血病的第三位。CML的分子生物学特征是存在bcr/abl融合基因，该基因通过转录翻译产生分子量为210KDa的融合蛋白P210bCT/abl，该融合蛋白具有 异常增高的酪氨酸激酶活性，使造血干细胞发生异常转化而导致CML发生。K562细胞系来 源于急变期CML病人，P2K)b^^呈阳性，是研究CML经典的细胞模型。目前治疗CML的前线化学药物是2001年新上市的格列卫(Glivec，或称STI571 ) [1]。 属于a—苯胺嘧啶衍生物，格列卫作用的机理是作用ATP与酪氨酸激酶结合位点，特异性抑 制ABL酪氨酸激酶。虽然应用格列卫能够使急变期CML完全缓解，但大部分病人对格列卫 的应答期较短，最终细胞对其耐药而使临床复发(。CML细胞对格列卫的耐药机理比较复杂。 由于格列卫上市不久的新药，目前还没有很好的方法克服CML对其耐药性。目前人们对CML 治疗研究是尝试延缓或阻止CML细胞对格列卫产生耐药性，其中通过筛选发现与格列卫不 同结构、不同作用机制的活性化合物，克服细胞对格列卫的耐药性，或与格列卫合并使用克 服细胞的耐药性，成为CML治疗研究的一个重要方向。
技术实现思路
本专利技术提供了一种大规模发酵生产埃博霉素B的方法。 具体的说，本专利技术方法包括如下步骤(a) .种子液在发酵罐发酵培养12 96小时，加入1% 10%吸附剂，吸附代谢产物(b) .发酵100-150小时后停止发酵，稠布过滤发酵液收获吸附剂(c) .吸附剂用异丙醇提取后减压浓縮或用水浸润，再用乙酸乙脂萃取旋转蒸发至干，得含埃博霉素B粗提物(d) .提取物使用低级醇溶解后，先经过常压柱层析用低级醇与氯代烷的混合液或单用低级醇洗脱(e) . HPLC检测并合并含埃博霉素B的馏份，减压浓縮到一定体积后，通过液相色谱进一歩纯化，得到纯化的埃博霉素B。步骤a中的种子液可由冻存菌种逐级放大培养后再转入培养基中培养1 5天得到，菌种 可为商业菌种如纤维堆囊菌ATCC 15384号经紫外或诱变剂诱变菌种，或为土壤中分离得到的 其他纤维堆囊菌种。吸附剂优选弱极性大孔吸附树脂，如AB-8、 DA201等。发酵所用培养基包括淀粉1 35g/L,糖l 10g/L，黄豆粉2 30g/L,酵母提取物2 30 g/L;还可加入无机盐或调节pH值的酸、碱，例如加入CaCl2.2H20 lg/L, MgS04.7H20 lg/L， Fe-EDTA8mg/L。所述糖可选用单糖或二糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖等。歩骤b中，发酵过程中可补加葡萄糖或复合料(淀粉、黄豆粉等)，提高埃博霉素B的产步骤c中，用异丙醇提取时优选的与吸附剂的体积/重量比为2 3: 1，分次提取2 3次，浓缩至原体积的1/10 1/5步骤d中，柱层析填料可选用硅胶或葡聚糖凝胶LH-20，低级醇可选用甲醇或乙醇，氯代烷可选用二氯甲烷或氯仿。步骤e中优选的采用反相C-18制备型液相色谱进行纯化。本方法制备得到的埃博霉素B经结构确证，与文献报道一致(表l)表1.埃博霉素B的'H-NMR和'3C-NMR__5 H(mult. / in Hz)_ S c(咖lt.)_文献值(CDCl3)样品值(CD3OD) 文献值(CDCh) 样品值(CDC1》本专利技术所提供的埃博霉素B制备方法具有如下优点-1) 适用性强，适合于多种工业菌种2) 实现了设备、试剂的国产化，成本低廉3) 操作简便，易于大规模生产另一方面，本专利技术还提供了一种埃博霉素B的药物组合物，含有埃博霉素B和聚乙二醇。 该组合物可制成注射剂或冻干粉，例如由埃博霉素B溶解于合适分子量大小的聚乙二醇制备得 到。其规格可根据使用剂量调整，优选为每支2. 5mg 25mg。临用时用生理盐水稀释或溶解成12s 2b33-OH45677-OH89a9b10a10b11alib1213 14a 14b15161718192021222324252627170. 6 (s)170. 539. 3 (t)39.272.9(d)72.953. 2 (s)53. 1220. 7 (s)220. 642.9(d)42.974, 1 (d)74. 136.5(d)36.430.8(t)30.822. 4 (t)22. 832. 4 (t)32. 161. 7(d)61. 361. 4 (s)61. 732. l(t)32. 477. 3 (d)77.0137. 6 (s)137. 5119. 7(d)119. 7151. 9(s)151.8116. 1(d)116. 1165. 2 (s)165. 119. 2 (q)19. 119. 7(q)19. 721. 5 (q)21.413. 6 (q)13.717. l(q)17. 122. 8 (q)22.415. 9 (q)15.82.54(dd,月4. 1,9. 6) 2.35(dd,,14. 1，3. 0)4. 21(m)4. 19 (bs)2.49(>15, 10. 2) 2. 43(>15，3.6) 4. 223. 29 (dq) 3. 76(ddd) 2. 64(bd)3.29 3. 651.69 1.55 1.55 1.57 1. 55 1.69 1.552.80(dd, ,7.7,4. 6)2. lO(ddd)1.91(ddd) 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大规模发酵生产埃博霉素Ｂ的方法，其特征在于包括如下步骤：（ａ）种子液在发酵罐发酵培养１２～９６小时，加入１％～１０％吸附剂，吸附代谢产物；（ｂ）发酵１００－１５０小时后停止发酵，稠布过滤发酵液收获吸附剂；（ｃ）吸附剂用异丙醇提取后减压浓缩或用水浸润，再用乙酸乙脂萃取旋转蒸发至干，得埃博霉素Ｂ粗提物；（ｄ）提取物用低级醇溶解后，经过常压柱层析用低级醇与氯代烷的混合液或单用低级醇洗脱；（ｅ）ＨＰＬＣ检测并合并含埃博霉素Ｂ的馏份，减压浓缩到一定体积后，通过液相色谱进一步纯化，得到纯化的埃博霉素Ｂ。

【技术特征摘要】
1.一种大规模发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于包括如下步骤(a)种子液在发酵罐发酵培养12～96小时，加入1％～10％吸附剂，吸附代谢产物；(b)发酵100-150小时后停止发酵，稠布过滤发酵液收获吸附剂；(c)吸附剂用异丙醇提取后减压浓缩或用水浸润，再用乙酸乙脂萃取旋转蒸发至干，得埃博霉素B粗提物；(d)提取物用低级醇溶解后，经过常压柱层析用低级醇与氯代烷的混合液或单用低级醇洗脱；(e)HPLC检测并合并含埃博霉素B的馏份，减压浓缩到一定体积后，通过液相色谱进一步纯化，得到纯化的埃博霉素B。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中发酵所用培养基包括淀粉1 35 g/L, 糖l 10g/L，黄豆粉2 30g/L，酵母提取物2 30 g/L。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养基中糖选自葡萄糖、果糖或...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆林，王赫，肖凤君，王石齐，李学林，易志恒，
申请(专利权)人：湖南迪诺制药有限公司，中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]