本发明专利技术涉及一种生产含低神经酸、低二十碳五烯酸（ＥＰＡ）的花生四烯酸油脂的方法。本发明专利技术的方法选用深黄被孢霉为出发菌株，经菌种活化、摇瓶菌种制备、发酵，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、ＥＰＡ含量的花生四烯酸油脂。采用深黄被孢霉作为发酵生产菌种，油脂生产能力可以提高１－３倍，花生四烯酸产量可以提高１－３倍；发酵条件简单，发酵过程利于控制；可以获得高品质的花生四烯酸混合油脂；低神经酸、低二十碳五烯酸（ＥＰＡ）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术，具体涉及一种生产含低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)的 花生四烯酸油脂的方法。
技术介绍
花生四烯酸，英文为Arachidonic acid，简称AA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸，它 是一种人体必需脂肪酸，属于n-6系列的多不饱和脂肪酸，简记为20 4(n-6)大量研究表 明，人体缺乏多不饱和脂肪酸将引起机体功能失调，导致某些疾病，而补充多不饱和脂肪酸 则可预防或治疗这些疾病，如婴儿缺乏花生四烯酸和DHA，可造成永久性智力低下和视力障 碍，6-12岁儿童的皮肤瘙痒、眼角干燥、上课注意力不集中，数学成绩下降等症状与其血浆 中花生四烯酸和DHA含量低有明显的正相关。同时研究表明，花生四烯酸对高血压、高血 脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防和治疗也有显著的效果。世界卫生组织和国际粮农组 织针对人类花生四烯酸摄入量的不足，建议在婴儿配方奶粉中添加花生四烯酸，提高婴幼 儿的健康水平。因此，花生四烯酸既是一种营养强化剂，同时也是人类重要的保健品。目前 市场销售的花生四烯酸产品，主要从深海鱼油中提取，由于原料的限制，花生四烯酸含量低 且很不稳定，而且产量低、成本高，无法进行规模化生产。近年来，马泰克生物科学有限公 司在中国申请了一项专利，公开号CN1175976A(名称花生四烯酸及其生产和使用方法)， 它采用高山被孢霉菌种，通过发酵法进行生产，但仍然存在菌种活性低、油脂产量低、花生 四烯酸生产能力低等缺点。武汉烯王生物工程有限公司在中国申请了一项专利，公开号 CN1362522A (名称用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法)，它采用经离 子注入法诱变筛选的一株高山被孢霉菌种，通过发酵法进行生产，但因采用了离子注入法 诱变菌进行生产，不为消费者所认同。而且目前所有公开的专利文献均未对所生产的花生 四烯酸混合油脂中的神经酸的含量进行限制，而经研究表明神经酸对婴幼儿的发育具有不 良影响，国外的消费群体已对花生四烯酸混合油脂中的神经酸含量提出了限量要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法， 该方法得到的产品具有花生四烯酸含量高，神经酸、二十碳五烯酸(EPA)含量低的特点。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四 烯酸油脂的方法，其特征在于它包括如下步骤1)、菌种活化制备活化培养基200g马铃薯，水1000ml，10-20g葡萄糖，17-20g琼脂，5-10g氮 源；所述的氮源包括但不限于酵母膏、酵母粉、花生粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、硝酸钾 或硝酸钠；将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，325-280C，培养箱湿度40-50%，培养3_4天，得活化菌种，备用；2)摇瓶菌种制备将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培 养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为18-20g/L葡萄糖，10-15g/L酵母膏；通入压 缩空气，通气量为0. 4-0. 6VVM，摇床转速为100-250rpm，培养温度为20_30°C，振荡培养3_5 天；从培养箱中取出后置于4-10°C条件下保持60-120min，得摇瓶菌种，备用；3)发酵将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中进行发酵培养，接种量 为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的8-20%，发酵培养基的最佳配方为葡萄糖10-30g/L， 酵母膏10-20g/L，硝酸钠lg/L ；用l-5mol/L的酸(硫酸、草酸或柠檬酸等)或碱(氢氧化钠 或氨水等)调节pH至5. 5-7 ；通入洁净压缩空气，通气量为0. 4-0. 6VVM ；转速100-200rpm， 压力0. 01-0. 05Mpa,温度20_30°C，期间每隔24h补充10g/L的碳源，每48h补充lg/L的 硝酸钠，发酵培养7-9天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油 脂。从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法包括a、干法 以抽真空加热脱水的方式烘干菌体，经粉碎后以有机溶剂萃取制得毛油，并经精炼后制得 成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)；b、湿法以湿的菌体直接破壁后有机溶剂萃 取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。有机溶剂为正己烷或丁烷等。所得产品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)中，包含至少约60% (质量) 甘油三脂形式的花生四烯酸，EPA的含量不超过花生四烯酸含量的十五分之一，神经酸的含 量不超过总油脂(产品)质量含量的3%。采用上述技术方案，使得本专利技术与已有技术相比具有以下优点1、采用深黄被孢霉作为发酵生产菌种，油脂生产能力可以提高1-3倍，花生四烯 酸产量可以提高1-3倍。2、发酵条件简单，发酵过程利于控制。3、可以获得高品质的花生四烯酸混合油脂。4、低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)。该方法所用得产品是人类，特别是婴幼儿群体的一种营养强化剂，是一种重要的 保健品。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的 内容不仅仅局限于下面的实施例。本专利技术所提供的深黄被孢霉(Mortierella isabellina)，为一株经自然分离筛选 得到的野生菌种，已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号3. 3410 ；为市售产PΡΠ O实施例1 (摇瓶发酵)1)、菌种活化制备活化培养基活化培养基为以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基为基础培养 基，额外添加氮源，活化培养基的配方为200g马铃薯，水1000ml，IOg葡萄糖，17g琼脂，5g 酵母膏；具体为称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸半个小时，纱布过滤， 再加IOg葡萄糖、17g琼脂和5g酵母膏，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约 5-10ml (视试管大小而定)，15磅蒸气(121°C)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却 后贮存备用。将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养， 250C，培养箱湿度40 %，培养4天，得活化菌种，备用；2)摇瓶菌种制备将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培 养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏；通入压缩空 气，通气量为0. 5VVM(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，摇床转速为160rpm，培养温 度为27°C，振荡培养4天；从培养箱中取出后置于4°C条件下保持60min，得摇瓶菌种，备 用；3)摇瓶发酵将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌 种所占发酵培养基体积的10% (ν/ν)，摇瓶装液量为20% (摇瓶菌种和发酵培养基占摇瓶 体积的20%)；发酵培养基配方为葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，硝酸钠lg/L;用2mol/L硫 酸调节PH为5. 5 ；通入洁净压缩空气，通气量为0. 5VVM ；转速200rpm，压力0. 02Mpa，温度 250C，期间每隔24h补充10g/L的碳源(葡萄糖)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
发酵生产低神经酸、ＥＰＡ含量的花生四烯酸油脂的方法，其特征在于它包括如下步骤：１）、菌种活化：制备活化培养基：２００ｇ马铃薯，水１０００ｍｌ，１０－２０ｇ葡萄糖，１７－２０ｇ琼脂，５－１０ｇ氮源；所述的氮源为酵母膏、酵母粉、花生粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、硝酸钾或硝酸钠；将深黄被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）在活化培养基斜面进行菌种活化培养，２５－２８℃，培养箱湿度４０－５０％，培养３－４天，得活化菌种，备用；２）摇瓶菌种制备：将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：１８－２０ｇ／Ｌ葡萄糖，１０－１５ｇ／Ｌ酵母膏；通入压缩空气，通气量为０．４－０．６ＶＶＭ，摇床转速为１００－２５０ｒｐｍ，培养温度为２０－３０℃，振荡培养３－５天；从培养箱中取出后置于４－１０℃条件下保持６０－１２０ｍｉｎ，得摇瓶菌种，备用；３）发酵：将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的８－２０％，发酵培养基配方为：碳源１０－３０ｇ／Ｌ，氮源１０－２１ｇ／Ｌ；用１－５ｍｏｌ／Ｌ的酸或碱调节ｐＨ至５．５－７；通入洁净压缩空气，通气量为０．４－０．６ＶＶＭ；转速１００－２００ｒｐｍ，压力０．０１－０．０５Ｍｐａ，温度２０－３０℃，期间每隔２４ｈ补充１０ｇ／Ｌ的碳源，每４８ｈ补充１ｇ／Ｌ的硝酸钠，发酵培养７－９天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、ＥＰＡ含量的花生四烯酸油脂。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁伟，岳传静，岳传军，吴志伟，
申请(专利权)人：武汉麦可得生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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