控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法，属于发酵制备丙酮酸技术领域。本发明专利技术采用初始葡萄糖浓度为８０ｇ／Ｌ，初始维生素浓度６ｍＬ／Ｌ；２４～６８ｈ流加葡萄糖流加液，控制发酵液中葡萄糖浓度为２０－３０ｇ／Ｌ，流加维生素流加液，维生素流加速率为：２４－２５ｈ为３．１ｍＬ／ｈ，２５－３４ｈ流速每小时增加０．２ｍＬ／ｈ，末一小时的流速达５．１ｍＬ／ｈ，３４－３５ｈ减至１．４ｍＬ／ｈ，３５－６８ｈ流速每小时增加０．０５ｍＬ／ｈ，末一小时的流速达３ｍＬ／ｈ，６８－８８ｈ减至１ｍＬ／ｈ。在此控制策略下，丙酮酸产量由对照例的６５．５ｇ／Ｌ提高到８０～９０ｇ／Ｌ，残留葡萄糖由４６．９ｇ／Ｌ降低至５．０ｇ／Ｌ以下。本发明专利技术生产的丙酮酸可用于化工、制药等领域。由于残留葡萄糖浓度较低，提高了下游处理时的效率。本发明专利技术的策略对其它发酵产品的生产也有指导意义。
【技术实现步骤摘要】
—种，涉及光滑球拟酵母发酵制备丙酮酸
技术背景 丙酮酸又称2-氧代丙酸、a -酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋 酸香气和愉快香味，是最重要的a-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十 分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研 究中有着广泛的用途。自从20世纪50年代开始发酵法生产丙酮酸以来，国内外对丙酮酸 生物合成的研究越来越深入，涉及菌种选育、营养条件、维生素、溶氧水平等各个方面。为了 达到丙酮酸产量、转化率、生产强度的高度统一，研究者又从ATP酶入手研究了丙酮酸生物 合成中的能量代谢，并对呼吸作用作了一些有益的研究。利用葡萄糖和维生素控制策略提 高丙酮酸的产量及生产强度，降低发酵液中残留葡萄糖浓度，尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种葡萄糖和维生素控制策略提高发酵法生产丙酮酸时的 丙酮酸产量、得率及生产强度，降低发酵液中残留葡萄糖浓度的方法，利用本专利技术能提高丙 酮酸发酵的产量、生产强度和得率，并且降低发酵液中的残留葡萄糖浓度，利于提取。 本专利技术的技术方案一种控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方 法，是利用多重营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019发酵生产 丙酮酸的过程中，控制发酵体系中的葡萄糖和维生素的浓度水平，采用初始葡萄糖浓度为 80g/L，初始维生素浓度6mL/L ;24 68h流加葡萄糖流加液，控制发酵液中葡萄糖浓度为 20-30g/L，流加维生素流加液，维生素流加速率为24-25h为3. lmL/h， 25_34h流速每小时 增加0. 2mL/h，末一小时的流速达5. lmL/h，34-35h减至1. 4mL/h，35-68h流速每小时增加 0. 05mL/h，末一小时的流速达3mL/h，68-88h减至lmL/h ; 所述发酵过程中培养基组成以g/L计葡萄糖80，氯化铵7，乙酸钠6， KH2P04 5， Mg2S04 7H20 0. 8，维生素溶液10mL/L，微量元素溶液10mL/L， pH5. 5 ; 维生素溶液(L):烟酸0. 8g，盐酸硫胺素2mg，盐酸吡哆醇10mg，生物素lmg ;微量 元素溶液(L) :CuS04*5H20 0. 05g，FeS04 *7H20 2g， MnCl2 4H20 0. 2g， CaCl2 2H20 2g， ZnCl2 0. 5g，2mol/L HC1定容至1L ; 葡萄糖流加液组成为葡萄糖800g/L，氯化铵58g/ ;维生素流加液组成为盐酸硫 胺素400 ii g/L，生物素200 ii g/L，烟酸80mg/L，盐酸吡哆醇2mg/L ; 培养方法7L发酵罐中装液量3L，接种量12X，转速为400r/m，通气量为lvvm，温 度为30°C ，流加8mol/L的NaOH控制pH为5. 5， 24h后向发酵罐中按上述要求流加葡萄糖流 加液和维生素流加液。 菌种光滑球拟酵母T. glabrata CCTCC M202019, NA、 Bio、 B6 4种维生素营养3缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育。该菌种已申请中国专利，申请 号为02113142. 2，公开号为CN1392246A。 培养基和培养方法 配制维生素的混合溶液(L):烟酸O. 8g，盐酸硫胺素2mg，盐酸吡哆醇10mg，生物素 lmg。配制微量元素混合溶液(L) :CuS04 5H20 0. 05g， FeS04 7H20 2g， MnCl2 4H20 0. 2g， CaCl2 2H20 2g， ZnCl2 0. 5g，2mol/L HC1定容至1L。 斜面和种子培养基(L):葡萄糖30g，蛋白胨20g， KH2P04 lg， MgS04 7H20 0. 5g，维 生素溶液10mL，琼脂20g(斜面添加);PH5. 5。 发酵培养基(L):葡萄糖80g，氯化铵7g，乙酸钠6g，KH2P04 5g，Mg2S04 *7H20 0. 8g， 维生素溶液lOmL，微量元素溶液10mL， pH5. 5。 培养方法为 种子培养从新鲜斜面上接一环菌接入种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在 30°C ， 200r/min下培养18h。再按1 %接种量接入二级种子培养基(300mL/1000mL锥形瓶)， 在30°C ， 220r/min下培养18h。 发酵培养KBT型7L全自动发酵罐(韩国KoBio Technol. Co. ， Ltd.)中装液量 3L，接种量12% ，转速为400r/m，通气量为lvvm，温度为30°C ，流加8mol/L的NaOH控制pH 为5. 5。 24h后向发酵罐中按要求流加营养物，同时加大通气量保证通气量为lvvm，温度、 pH和溶氧分别采用相应的电极进行自动控制。 分析方法 将含有4mL发酵液的塑料离心管置于台式高速离心机(TGL-16G)中，于lOOOOr/ min离心5min，取上清夜进行分析测定。 吸取O. lmL发酵液，定容后以水为空白，在660nm处测定0D值。然后根据1 0D66。二0.23g/(细胞干重)的换算关系，计算得出细胞干重。 葡萄糖采用3， 5- 二硝基水杨酸(DNS)法测定。 丙酮酸及a -酮戊二酸的测定高效液相色谱(HPLC)法。 色谱条件为:StableBond C18反相柱，柱温28°C，检测器UV 210nm，流动相: 0. 1 % (v/v) H3P04，流速1. Oml/min，进样体积:10 ii L。 相关技术条件对丙酮酸发酵性能的影响在此控制策略下，丙酮酸产量由对照例 的65. 5g/L提高到80 90g/L，残留葡萄糖由46. 9g/L降低至5. Og/L以下。 本专利技术的有益效果在利用多重营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(T.glabrata) CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的过程中，葡萄糖和维生素浓度可以显著影响丙酮酸的得 率和产量。以往丙酮酸发酵中葡萄糖和维生素的供给为发酵起始向培养基中一次性添加以 保证整个过程细胞生长和丙酮酸合成的微妙平衡。然而，维生素的一次性添加必然导致发 酵前期的过量和发酵中后期的匮乏，由此造成发酵前期丙酮酸产率较低而发酵后期细胞活 力受限，从而导致丙酮酸生产强度和产率难以达到统一。利用本专利技术能强化细胞活力而降 低发酵液中残留葡萄糖，提高丙酮酸发酵的生产强度；并且可以通过流加维生素有效延长 发酵时间。本专利技术的营养因子添加模式对其它发酵产品的生产具有一定的指导意义。具体实施方式 对照实施例 在7L罐中进行分批发酵，初始体积3L，发酵初糖180g/L (总糖540g)，添加维生素 10mL/L (总共添加30mL)，发酵96h，丙酮酸产量为65. 5g/L (总酸229. 3g)，发酵液中残留葡 萄糖46. 9g/L(164. 2g)，糖酸转化率为0. 61g/g。 实施例 在7L罐中进行流加发酵，初始体积3L，发酵初糖80g/L (总糖540g)，初始添加维 生素6mL/L(总共添加42mL)，按权利要求书中方法发酵92h，丙酮酸产量为91. 2g/L(总酸 4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种控制葡萄糖和维生素浓度提高发酵制备丙酮酸产量的方法，其特征是利用多重营养缺陷型光滑球拟酵母（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｇｌａｂｒａｔａ）ＣＣＴＣＣＭ２０２０１９发酵生产丙酮酸的过程中，控制发酵体系中的葡萄糖和维生素的浓度水平，采用初始葡萄糖浓度为８０ｇ／Ｌ，初始维生素浓度６ｍＬ／Ｌ；２４～６８ｈ流加葡萄糖流加液，控制发酵液中葡萄糖浓度为２０－３０ｇ／Ｌ，流加维生素流加液，维生素流加速率为：２４－２５ｈ为３．１ｍＬ／ｈ，２５－３４ｈ流速每小时增加０．２ｍＬ／ｈ，末一小时的流速达５．１ｍＬ／ｈ，３４－３５ｈ减至１．４ｍＬ／ｈ，３５－６８ｈ流速每小时增加０．０５ｍＬ／ｈ，末一小时的流速达３ｍＬ／ｈ，６８－８８ｈ减至１ｍＬ／ｈ；所述发酵过程中培养基组成以ｇ／Ｌ计：葡萄糖８０，氯化铵７，乙酸钠６，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］５，Ｍｇ↓［２］ＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．８，维生素溶液１０ｍＬ／Ｌ，微量元素溶液１０ｍｌ／Ｌ，ｐＨ５．５；维生素溶液（Ｌ）：烟酸０．８ｇ，盐酸硫胺素２ｍｇ，盐酸吡哆醇１０ｍｇ，生物素１ｍｇ；微量元素溶液（Ｌ）：ＣｕＳＯ↓［４］.５Ｈ↓［２］Ｏ０．０５ｇ，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２ｇ，ＭｎＣｌ↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ０．２ｇ，ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ２ｇ，ＺｎＣｌ↓［２］０．５ｇ，２ｍｏｌ／ＬＨＣｌ定容至１Ｌ；葡萄糖流加液组成为：葡萄糖８００ｇ／Ｌ，氯化铵５８ｇ／Ｌ；维生素流加液组成为：盐酸硫胺素４００μｇ／Ｌ，生物素２００μｇ／Ｌ，烟酸８０ｍｇ／Ｌ，盐酸吡哆醇２ｍｇ／Ｌ；培养方法：７Ｌ发酵罐中装液量３Ｌ，接种量１２％，转速为４００ｒ／ｍ，通气量为１ｖｖｍ，温度为３０℃，流加８ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ控制ｐＨ为５．５，２４ｈ后向发酵罐中按上述要求流加葡萄糖流加液和维生素流加液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，许庆龙，梁楠，刘立明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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