全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸－Ｎ－乙酰葡糖胺的方法，以尿苷酸、葡糖胺和磷酸根离子为底物，以果糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸－Ｎ－乙酰葡糖胺。本发明专利技术采用全细胞生物催化合成尿苷二磷酸－Ｎ－乙酰葡糖胺，克服了发酵法代谢产物复杂、底物转化率低等缺陷，简化了后续的分离工艺；与酶法相比由于使用的是全细胞，酶的稳定性更好，耐有机溶剂的适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的制备方法，尤其涉及全细胞生物催化合成 尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法。技术背景在过去很长的一段时间内，碳水化合物及其衍生物并没有得到很大发展，但近十年 来，随着发现糖类物质在细胞识别，免疫方面的重要生理作用，糖类物质又日益受到了 重视并有了长足的进步。尤其是寡糖，它在生物体内起着调节细胞内外联系的作用，并 参与激素的调节和抗体的免疫识别，能激活植物的自我防卫系统、诱导根瘤菌的固氮作 用、可以与入侵的微生物上的糖蛋白相结合而阻止这些微生物对人体正常细胞的侵袭等 等,故有必要对糖核苷酸尤其是作为含有许多生理活性糖链链芯部分的N-乙酰葡糖胺供体的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的合成进行深入的研究。生物体中尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺中涉及不同氨基糖之间的转化，且作为生物合 成粘多糖、糖肽、脂蛋白和几丁质等的氨基糖成分的重要前体物质。尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的生物催化合成，从能量利用方面看，是较高难度的合 成反应。首先添加在反应液中的葡糖胺通过与EMP途径的化学能生成系统共轭，葡糖 胺被磷酸化为葡糖胺-6-磷酸，再进一步消耗乙酰-辅酶A,而被转化为N-乙酰葡糖胺-l-磷酸；另一方面，作为构成核苷酸部分原料的尿苷酸，通过与EMP途径的能量生成系 统共轭，被磷酸化为尿苷三磷酸，最后通过缩合反应，生成UDPAG。目前合成UDPAG的方法有化学法、发酵法。此方法成 本高昂，操作繁琐，稳定性差，真正实现工业化还有待探讨。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种低成本、便于后续分离操作的尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖 胺的制备方法。本专利技术的关键在于1、 全细胞催化由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有活细胞所处 的状态和特定位置，因此用酵母细胞直接作为,源进行酶催化反应，能够迅速有效地完 成多步酶催化反应。在本专利技术中利用停止生长的酵母，釆用全细胞催化技术，同时添加 促渗透剂对酵母进行细胞渗透性增强处理，从而既保持了细胞酶系的完整性，又有利于 底物的利用，并使得产物能够从胞内释放出来，从而可以降低后续分离的难度。本专利技术是建立在全细胞催化的基础上的，其特点在于克服了其它方法底物转化率不 高、难于实现能量和辅酶再生的种间耦合，不易改变细胞的通透性等缺陷。特别是与酶 催化相比，由于使用的是全细胞，胞内的酶受细胞壁/细胞膜的保护，酶稳定性更好，半 衰期更长，更易实现能量和辅酶的再生；胞内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以 弥补酶法催化中级联催化不易实现的不足，同时省去酶的纯化过程，制备简单，成本低藤《2、 利用酵母合成UDPAG的自身代谢途径在酵母细胞中生物合成UDPAG从葡萄糖开始，在己糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶的 作用下变为6-磷酸果糖，再以6-磷酸果糖和谷氨酰胺为底物在氨合成酶作用下转化成为 6-磷酸葡萄糖胺，随后6-磷酸葡萄糖胺被乙酰化、异构化乙酰葡糖胺-l-磷酸，最后被相 应的焦磷酸化酶转化为UDPAG。因此谷氨酰胺的加入可以利用酵母自身的合成途径， 促进UDPAG的合成。本专利技术直接加入葡糖胺，利用己糖激酶被催化成6"磷酸葡萄糖胺。而己糖激酶的优 先底物为葡萄糖，体系中一旦存在葡萄糖则葡糖胺的磷酸化反应很弱 [Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392^2000，因此用果糖代替葡萄糖作为能源，可以 消除葡糖胺磷酸化受到抑制的同时还可以利用酵母自身的合成途径，作为合成的底物合 成UDPAG。3、 小分子效应物的加入代谢通量经调解因子镁离子、钾离子调节后，代谢途径流量分配发生了重大改变， EMP主途径得以加强，提高了能量的利用率，部分解决了 UTP合成和糖部分合成反应 过程中需要大量ATP的问题。反应过程中底物6-磷酸-葡糖胺和乙酰辅酶A在葡糖胺"6-磷酸乙酰转移酶的催化下转变为6-磷酸-N-乙酰葡糖胺，此步反应为整个催化合成过程中的限速反应 [Biosci.Biotechnol.Biochem.，64(2)，386-392，2000，因此解决乙酰辅酶A的再生问题，是 本专利技术的关键。酵母内乙酰辅酶A的形成途径有两条 一是线粒体内的丙酮酸直接氧化 脱羧途径，由丙酮酸脱氢酶将丙酮酸氧化为乙載辅,A: 二是细胞质内的丙酮酸脱羧支 路，在丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的联合作用下将丙酮酸转化为乙 酰辅酶A。醋酸钠可以利用酵母细胞中丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶 的联合作用生成乙酰辅酶A,所以反应体系中加入醋酸根离子，可以促进乙酰辅酶A的 再生，对促进UDPAG的合成有很大作用。具体来说，本专利技术的目的通过以下技术措施达到一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸，N-乙酰葡糖胺的方法，其特征在于以尿苷酸 (UMP)、葡糖胺和磷酸根离子为底物，以果糖为能量供体，加入小分子化学效应物质， 利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。其中，底物中，尿苷酸的起始反应浓度为S 50mM，优选1(M5mM;葡糖胺的起 始反应浓度为10 70rnM，优选15"45mM;磷酸根离子起始反应浓度为60~300 mM,优 选80 180mM。其中，果糖的起始反应浓度为20~180mM,优选150mM。其中，所述的小分子化学效应物质为无机小分子和有机小分子；其中无机小分子为 镁离子和钾离子的组合物；有机小分子为醋酸根离子和谷氨酰胺的组合物；Mg^起始反 应浓度为2~30mM，优选2~22mM; K+起始反应浓度为5~80mM，优选15~65mM; CH3C0CT起始反应浓度为5~90mM,优选5~65mM:谷氨酰胺起始反应浓度为5~80mM， 优选15~60mM。其中，所述的酵母为酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母 属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或酿酒酵母属中能够利用尿苷酸和葡糖胺 为前体合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的酵母，优选酿酒酵母、近平滑假丝酵母、面包 酵母、奥默列氏毕赤酵母、白色球拟酵母、类球形德巴利酵母、鲁氏接合酵母、马克斯 克鲁维酵母、杰丁汉逊酵母或异酒香酵母酵母细胞的使用量为按湿菌体16(K400g/L, 优选25(M00g/L,即对于总体积为1L的反应液，需加入湿酵母160~400g,优选加入 25(M00g。其中，所述的有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的 通透性改变过的酵母细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波 处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。表面活性剂法中使用的表面活性剂包括非离子型表明活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-IOO,阳离子性表面活性剂十六烷基三甲胺《溴化物或阴离子表明活性剂月桂酸*肌 氨酸盐，使用量为0.1一0g/L，优选l~20g/L,即表面活性剂法处理酵母细胞时，将表面 活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1一0g,优选加入l 20g。有机溶剂法中使用的有机溶剂为甲苯、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1~70ml/L, 优选l~40ml/L,即有机溶剂法处理酵母细胞时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体 积为1L的反应液，加入0.1 70mL,优选加入140mL。其它处理细胞透性的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸－Ｎ－乙酰葡糖胺的方法，其特征在于以尿苷酸、葡糖胺和磷酸根离子为底物，以果糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化合成尿苷二磷酸－Ｎ－乙酰葡糖胺。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，曹海萍，张磊，熊健，柏建新，李振江，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]