聚酮化合物和其它天然产物的产生制造技术

本发明专利技术涉及聚酮化合物和其他天然产物的产生，还涉及化合物文库和分别的新化合物。一个重要的方面是新ＦＫＢＰ－配体类似物的分离和潜在用途以及产生这些化合物的宿主细胞。本发明专利技术尤其涉及用于有效转化产生ＦＫＢＰ类似物的菌株的方法和重组细胞，其中克隆基因或基因盒被表达以产生新化合物如聚酮化合物（特别是雷帕霉素）ＦＫＢＰ－配体类似物，还涉及它们的制备方法和在其中应用的工具（例如核酸、载体、基因盒和遗传修饰的菌株）。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及聚酮化合物(polyketides )和其他天然产物的产生，还涉 及化合物文库和分别的新化合物。 一个重要的方面是新FKBP-配体类似物 的分离和潜在用途以及产生这些化合物的宿主细胞。本专利技术尤其涉及用于 有效转化产生FKBP类似物的菌林的方法和重组细胞，其中克隆基因或基 因盒被表达以产生新化合物如聚酮化合物(特别是雷帕霉素)FKBP-配体类 似物，还涉及它们的制备方法和在其中应用的工具(例如核酸、载体、基因 盒和遗传修饰的菌株)。
技术介绍
雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(附图说明图1)是由吸水链霉菌(Streptomyces hygrosc叩icus ) NRRL 5491(Sehgal等，1975; Veina等，1975;美国专利号: 3,929， 992;美国专利号3,993， 749)产生的带有连接到六氢吡咬羧酸内酯 的1，2，3-三羰基部分的亲脂性大环内酯(Paiva等，1991)。其它相关大环内 西旨(图2 )包括FK506 (tacrolimus) (Schreiber和Crabtree， 1992)、 FK520 (子嚢霉素或immunomycin) (Wu等，2000)、FK525 (Hatanaka H，等，1989)、 FK523 (Hatanaka, H.，等，1988)、 antascomicins (Fehr， T.，等，1996)和 meridamycin (Salituro等，1995)。对于本专利技术，雷帕霉素采用McAlpine 等(1991)的编号规定描述，其优于Findlay等(1980)或化学文摘(11" Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS)的编号规定。雷帕霉素作用的多方面模式显示出了该化合物的药理学价值，并强调 了分离该药物的新型衍生物的必要性。雷帕霉素显示出温和的抗真菌活性，主要抗假丝酵母(Candida )种，但也抗丝状真菌(Baker等，1978; Sehgal 等，1975; V6zina等，1975;美国专利号3,929,992;美国专利号3,993,749 )。 雷帕霉素在多种细胞类型中通过靶向信号转导途径抑制细胞增殖，例如通 过抑制细胞周期从G1到S-期的进行(Kuo等，1992)的信号转导途径。 在T细胞内，雷帕霉素抑制源自于IL-2受体的信号转导，并抑制T细胞 的后续自动增殖而导致抑制免疫反应。雷帕霉素的抑制效应并不限于T细 胞，因为雷帕霉素抑制许多哺乳动物细胞类型的增殖(Brunn等，1996)。 因此，在防止器官同种异体移植物的排斥中以及在治疗自身免疫性疾病中 (Kahan等，1991)，具有确定的或预计治疗，雷帕霉素是有效的免疫抑制 剂。它引起的负作用比标准的抗排斥治疗的低(Navia， 1996)。 40-O-(2-羟 基)乙基-雷帕霉素(SDZRAD, Certican， Everolimus)为雷帕霉素的半合成 类似物，其显示出免疫抑制的药理学作用(Sedrani， R.等，1998; U. S. 5,665,772)。目前，药物的临床功效正在第三期临床试验中(Kirchner等， 2000)。在体外试验中，雷帕霉素酯(:<:1-779 (Wyeth-Ayerst)抑制细胞生 长，在体内试验中，其抑制肺瘤生长(Yu等，2001 )。目前，药物正用于 第三期临床试验。深入研究的领域有(Kahan和Camardo， 2001 ):雷帕 霉素在慢性银屑病治疗中的价值(Kirby和Griffiths, 2001)、例如在PC12 细胞中刺激神经突瘤的功效的潜在应用(Lyons等，1994)、在受到机械 损伤后通过血管和平滑肌细胞阻碍对细胞因子的增殖反应(Gregory等， 1993 )以及其在防止同种异体移植物纤维化中的作用(Waller和Nicholson, 2001 )。最近^^导显示出，在器官移植患者中，雷帕霉素对进行长期免疫 抑制治疗患者的癌症发生率比其它免疫抑制疗法低，并且该降低的癌症发 生率是因为血管生成的抑制(Giiba等，2002)。已报道了亲免素配基的 亲神经活性与它们的免疫抑制的活性无关(Steiner等，1997),并报道了 如在专利申请W001/03692中略述的神经生长刺激受成熟类固醇受体复合 体的破坏而提高。已报道了例如高血脂和血小板减少症以及潜在的致畸效应的负作用(Hentges等，2001; Kahan和Camardo， 2001 )。总共7个丙酸和7个乙酸单位通过头尾缩合到莽草酸衍生的环己烷羧 酸起始单元合成雷帕霉素的聚酮化合物骨架(Paiva等，1991) 。 L-赖氨 酸衍生的亚氨基酸、六氢吡咬羧酸通过酰胺键缩合到聚酮化合物骨架的最 后一个醋酸上(Paiva等，1993)，然后进行内酯化作用以形成大环。已 测定了包含生物合成基因簇的107kb基因组区序列(Schwecke等，1995)。 对开放阅读框的分析揭示了编码模块(modular )聚酮化合物合成酶(PKS ) 的三个大基因(Aparicio等，1996; Schwecke等，1995)。在PKS基因 之间有编码具有与非核糖体肽合成酶的激活区相似序列蛋白的rapP基因，且认为其起类似作用(K6nig等，1997)。编码PKS基因的区域位于 编码认为对于雷帕霉素的合成是必须的酶的24个额外开放阅读框的两侧 (Moln6r等，1996)。这些包括以下的聚酮化合物后^务饰酶两个细胞色素 P-450单加氧酶，称为RapJ和RapN，相关的4失氧化还原蛋白RapO，和 三个潜在的SAM-依赖的O-转甲基酶Rapl， RapM和RapQ。其它相邻基 因在雷帕霉素的调节和输出中具有推定功能(Moh^r等，1996)。所述基 因簇也包含基因rapL，认为其产物RapL通过L-赖氨酸的环化脱氨作用 催化雷帕霉素前体L-六氢吡咬羧酸的形成(Khaw等，1998; Paiva等， 1993)。 rapL内导入移码突变使这样的体产生突变体，所述突变体不能产 生大量雷帕霉素，并用L-六氢吡咬羧酸添加至生长培养基恢复野生型水平 的雷帕霉素产量(Khaw等，1998)。雷帕霉素的环己烷环的生物合成前 体物源自于莽草酸途径(Lowden等，1996; Lowden等，2001)。其它密切 相关的大环内酯类，例如FK506(tacrolimus) (Schreiber和Crabtree， 1992)、 FK520 (子嚢霉素或immunomycin) (Wu等，2000)、 antascomicin (Fehr， T,， 等，1996)和meridamycin (Salituro等，1995)，都有共同的药效团，其与 FK506-结合蛋白(FKBPs)相互作用(图2)。因而，可认为雷帕霉素和相关化 合物，例如但不限于FK506、 FK520、 'hyg'、 FK523、 meridamycin、 antascomicin、 FK525和筑波霉素，为"FKBP-配基"。已发表了FK506基 因簇的部分序列(Motamedi等，1996; Motamedi等，1997; Motamedi和Shaf本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生掺入非天然起始单元的ＦＢＫＰ－配体类似物的方法，所述方法包括：　　　　（ａ）产生重组菌株，其中至少ｒａｐＫ同源物已经被缺失或失活；和　　　　（ｂ）将非天然起始单元送料至所述菌株。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MA格雷戈里，S盖瑟，H佩特克维奇，S莫斯，
申请(专利权)人：百奥帝卡技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]