一种利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，包括菌丝培养与收集、基因组ＤＮＡ的提取、ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测建立和ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测。本发明专利技术提供的利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种的方法，具有灵敏度高，所需要的ＤＮＡ用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。为猴头菇种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了快速有效的菌种鉴定体系，对科研和生产具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物的鉴定方法，具体涉及利用分子 标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，属生物
技术介绍
猴头菇(f/er/"^m w/"""^)猴头菇是著名的八大山珍之 一，与燕窝、鱼翅、海参并列为四大名肴。传统中医认为猴头菇性平、 味甘，有助消化、利五脏、润六肺的功能和补虚损的功效，能提高人体免 疫能力，对慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡等多种消化道疾病和神经衰 弱均有较好疗效。猴头菇营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪，富含人体必 需的多种氨基酸、多肽、多糖和脂肪族的酰胺物质及多种维生素的优良保 健食品。我国食用菌资源丰富，品种比较多，近年来,由于菌种管理制度不健全, 致使猴头菇菌种混乱,出现同名异物、同物异名的现象。大量的混淆不清的 菌种名称不但使产业技术无从规范,也使我国近10年来几乎没有按食用菌 育种技术规范选育出的优良品种。而大量使用的多数是十几年前选育的未 经系统筛选和测试的组织分离物。这些非品种的菌种又常被冠以新名,而其 区别性、 一致性和稳定性无从知晓。这种混淆和混乱不仅给生产环节带来 诸多不便，也对食用菌的科学研究与学术交流造成障碍。猴头菇的人工栽培己逐渐形成较大规模,创造了较好的经济效益。优质 的猴头菇菌种是获得高单产和高质量的前提与基础，这就决定了猴头菇菌 种在猴头菇产业中的重要地位。因此为了保证每批次的用种都准确无误， 减少不必要的损失，需要开发简便、快速、准确的菌株鉴定技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用分子标记技术鉴定猴头菇 猴杰菌种的快速检测方法。本专利技术的，包括菌丝培 养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR 产物的检测；其特征在于1、 SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是猴杰F/R，其中，猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3';2、 SCAR-PCR分子标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系为10XPCR buffer 2. 5 jal， 25,ol/L MgCL2 1 (il， 2.5 m mol/L dNTP 2 |il， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 jal， 10 u mol/L检测引物各1 ^d， lng 10ng/pl模板 DNA l(xl， ddH20 16.2 jil;SCAR-PCR反应条件为94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30个循环;72°C 5rain;3、 SCAR-PCR产物的检测结果在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增 出的分子量为4〗4bp的特异DNA条带，为猴头菇猴杰菌种的标志。本专利技术提供的利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种的方法，具有灵敏度 高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比， 具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。具体如下1、 检测时间短该检测方法所需时间只需要2—3天，而常规的拮抗 试验所需时间至少需要两周时间，常规形态学检测和出菇试验则需要至少 2个月的时间。2、 准确性高、容易判断，而且重复性好该检测方法以基因组DNA 为材料，DNA是稳定的遗传物质，不易受外界因素等的影响，同时它的 1012bp或371bp的显性标记判断一目了然，减少人为判断的偏差，大大提 高了准确性；常规的拮抗试验中，拮抗表现形式至少有3种，甚至更多， 有时表现形式不明显，还受培养环境的影响，拮抗表现不仅在种内的不同 品种之间会出现，同时在种间的菌株之间也会表现出来，给准确判断造成 困难；出菇试验更容易受到环境、时间等各方因素的影响，重复性差，加 大了检测困难；形态学检测在同一属种内的不同品种之间可区别的特征少， 有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识与经验，方可 做出准确的判断。3、 此外该方法得到的显性标记可减少猴头菇新品种认定的工作量，检 测时该方法只需要1个阳性菌株和1个阴性菌株对照便可快速比较，而用 常规形态学、拮抗试验、出菇试验方法来认定一个新品种，需要将所有同 种内的不同品种一起搬出来比较，才能做出正确的认定，这就要很大的人 力和物力，当品种多时可能使得认定工作无法进行。本专利技术对猴头苋种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了更为有 效的菌种鉴定体系，以及加强对我国猴头燕种质资源的保护工作都具有重 要意义。附图说明 图1为使用引物猴杰F/R检测猴头菇菌种扩增的DNA图 谱。其中M 17为泳道编号；左侧的数字表示DNA片段的分子量，箭头 所指是猴杰菌株特异性标记。具体实施方式 为了充分公开本专利技术的利用分子标记技术鉴定猴头 菇猴杰菌种的方法，以下结合实施例加以说明。实施例1: 一种利用分子标记技术鉴定猴头燕猴杰菌种的方法 一种，包括以下歩骤 一、菌丝培养与收集(一) 若供测试猴头燕菌株的保藏时间小于6个月，则菌丝培养按如下 方法进行1、 用接种耙耙碎含猴头菇菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；2、 放置在25。C摇床上，转速90 130r/min培养7 10d;3、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；4、 称取0.5 1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。(二) 若供测试猴头燕菌株保藏时间不小于6个月，则菌丝培养采用如 下方法1、 取猴头菇菌种豆块大小转接到PDA斜面上，25'C培养7 10天；2、 用接种耙耙碎含猴头菇菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；3、 放置在25。C摇床上，转速90 130r/min培养7 10d;4、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；5、 称取0.5 1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20。C备用。二、基因组DNA的提取，所述基因组DNA可以从菌株的菌丝体或子 实体中提取。1、取保存备用的猴头菇菌丝0.5 1.3g，或子实体0.5 1.3g，放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；2、 加2.5mL65r预热的抽提液，同时加入50 jil巯基乙醇，上下震荡， 使蛋白质变性沉淀；3、 65'C水浴lh，每隔10min振荡l次；4、 加入2.5 ml的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；5、 8000 r/min， 4。C离心10min，取上清到7ml离心管；6、 力Q 1/5体积65"预热的CTAB/NaCl混匀，加入2. 5 ml的氯仿异戊 醇混匀；7、 10000r/min， 4。C离心10min，取上清；8、 加入2.5ml 65。C预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65。C水浴lh至沉淀可见或可过夜；9、 12000r/min, 4。C离心10min后，小心去除上清液；10、 用O. 5ml TE溶液或无菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml饱和酚和0. 25m L氯仿异戊醇，混匀；12、 12000 r/min， 4。C离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无 水乙醇，混匀；13、 放置-20。C冰箱lh或过夜；14、 12本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，包括菌丝培养与收集、基因组ＤＮＡ的提取、ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测建立和ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测；其特征在于 （１）ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测，使用的检测引物是猴杰Ｆ／Ｒ，其中， 猴杰Ｆ是５′－ＣＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＴＧ－３′’，猴杰Ｒ是５′－ＣＧＴＴＣＣＡＣＣＣＣＴＡＣＧＴＴＴＡＧＣＣＴＣＡ－３′； （２）ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测建立，ＳＣＡＲ－ＰＣＲ扩增体系为１０×ＰＣＲ ｂ ｕｆｆｅｒ ２．５μｌ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣＬ↓［２］ １μｌ，２．５ｍ ｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２μｌ，５Ｕ／ｕｌＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３μｌ，１０μｍｏｌ／Ｌ检测引物各１μｌ，１ｎｇ～１０ｎｇ／μ ｌ模板ＤＮＡ １μｌ，ｄｄＨ↓［２］Ｏ １６．２μｌ； ＳＣＡＲ－ＰＣＲ反应条件为９４℃ １ｍｉｎ；９４℃ ４５ｓｅｃｏｎｄ，６２℃ ４５ｓｅｃｏｎｄ，７２℃ １ｍｉｎ，３０个循环；７２℃ ５ｍｉｎ； （３）ＳＣＡ Ｒ－ＰＣＲ产物的检测结果：在电泳检测的ＤＮＡ图谱中显示，扩增出的分子量为４１４ｂｐ的特异ＤＮＡ条带，为猴头菇猴杰菌种的标志。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱坚，江玉姬，谢宝贵，邓优锦，刘新锐，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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