本发明专利技术公开了一种由芽孢杆菌基因ｓｏｘ改造成的蛋白质，其具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５其中任意一个所示的氨基酸序列。本发明专利技术还同时公开了编码上述蛋白质的基因，其具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０其中任意一个所示的核苷酸序列。本发明专利技术还同时公开了一种肌氨酸氧化酶，该酶可以应用于临床测定肌酐。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到一个耐热型肌氨酸氧化酶及基因；该酶可以应用于临床测定肌酐。
技术介绍
肌酐是人体代谢的一种重要产物，它主要是由机体通过肾脏的过滤从血液进入尿液而 排出体外，健康肾脏的这一功能可保证将代谢过程中形成的肌酐不断地排出体外，而使血 液中的肌酐始终保持在一个较低的水平。如果肾脏发生病变，将不能有效地清除所形成的 肌酐，造成肌酐在血液中积累。因此血液和尿液的肌酐含量可反映肾脏的排泄功能，在临 床测定中，血清中的肌酐浓度是一项判断肾功能的重要指标。目前肌酐的测定方法主要有化学方法、酶促方法以及建立在酶促反应基础上的电气化 学方法。化学测定法由于其固有的缺陷，正在被发展起来的酶促方法所代替。而在各种酶 促肌酐测定方法中，以肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶酶促催化反应为基础的测 定方法日渐成熟并得到广泛使用。该方法是通过肌酐水解酶(creatinine amidohydrolase or creatininase EC 3. 5. 2.10，简称Crn)、肌酸7JC解酶(creatine amidinohydrolase or creatinase EC 3.5.3.3，简称Cre)、肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase EC 1.5.3.1， 简称S0X)或肌氨酸脱氢酶(sarcosine dehydrogenase EC 1.5.9.9)降解肌酐，测定其 代谢产物&02或甲醛的酶法测定系统。其原理是肌酐+H20 <肌画鹏〉肌酸肌酸+H20 〉尿素+肌氨酸肌氨酸+1￥) +02肌執酸氧化喊脱氧酶〉甘氨酸+甲醛+HA 此法具有酶反应的专一性强和灵敏度高等特点，肌氨酸氧化酶是测定过程中的关键酶 之一，其质量的好坏直接影响到测定结果的的可靠性。肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase EC 1.5.3.1，简称SOX )是肌酐降解酶系中研究 相对较多的一个酶。许多研究者已经从多种微生物如真菌、放线菌、细菌中分离得到SOX， 对其理化性质和分子生物学方面也做了较多的研究。根据SOX的亚基数可分为单聚体和多聚体肌氨酸氧化酶。不同来源的肌氨酸氧化酶其性质有较大差异，现将SOX的性质总结于表l。如表l所示，不同来源的SOX在pH稳 定性方面没有很大差异，但热稳定性方面则有较大差异，单亚基的整体上优于多亚基的 SOX。其中热稳定最高的肌氨酸氧化酶由及sp.NS-129等菌株产生，为55'C。表l、不同来源肌酸氧化酶的酶学性质<table>table see original document page 4</column></row><table>注表l中的"一"表示未知。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种热稳定性高的肌氨酸氧化酶。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一个由芽孢杆菌基因sox改造成的蛋白质，其具 有SEQIDNO: 1 SEQIDNO: 5其中任意一个所示的氨基酸序列。作为本专利技术的芽孢杆菌基因sox编码的蛋白质的改进其氨基酸序列还包括在SEQ ID NO: 1 SEQIDNO: 5其中任意一个所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一 个或多个氨基酸所生成的衍生物。本专利技术还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ IDNO:6 SEQ ID.NO: IO其中任意一个所示的核苷酸序列。作为本专利技术的基因的改进其核苷酸序列还包括在SEQIDNO: 6 SEQIDNO: 10其中任意一个所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸所生成的突变体、等位基因和衍生物。本专利技术还同时提供了一种肌氨酸氧化酶，其为包含上述核酸的转基因生物细胞。 本专利技术是针对以肌氨酸氧化酶、肌酸水解酶及肌酐水解酶组成的测定体系进行酶促肌酐测定方法所作的改进。专利技术人利用了现有的一株产肌氨酸氧化酶的芽孢杆菌BSD-8 (5fld//^ sp. BSD-8)，对该肌氨酸氧化酶的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示， 编码的蛋白质具有SEQIDNO: ll所示的氨基酸序列)进行了改造，从而使所得的酶的热 稳定性进一步提高。专利技术人利用了定向进化这种近二十年发展起来的蛋白质改造新技术，该技术可以在试 管中使蛋白质分子朝着预定的方向进化，是改善酶性能最有效的途径之一，己被用于许多 酶性能的改善，其中蛋白质热稳定性改善是定向进化试验的一个重要目标。本专利技术首先运用易错PCR方法构建肌氨酸氧化酶的突变基因文库，对该基因进行定向 进化，获得多个不同的热稳定性显著提高的突变体。之后通过定点突变的方法对突变体合 并以获得热稳定性进一步提高的肌氨酸氧化酶。采用本专利技术方法所获得的突变酶soxM2有三个氨基酸被替换，热稳定性比原S^"/m sp. BSD-8所产生的野生酶高5°C (由6(TC提高到65°C),是目前已知的热稳定性最高的肌 氨酸氧化酶。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。 图1是定向进化构建肌氨酸氧化酶突变文库的策略图。 图2是突变菌株S0X热稳定性CK:野生SOX的对比图中CK为野生酶；A-1， A-2， A-3， B-l， B-2为单点突变后的酶；A为A-1、 A-2 及A-3复合突变酶；B为B-l及B-2复合突变酶。图3是组合突变菌株S0X热稳定性CK:野生SOX的对比图中CK为野生酶；A-2， B-l， C为单点突变后的酶；B-l+C为B-l及C复合突变 酶；B-1+C+ A-2为B-1， C及A-2复合突变酶。图4是温度对SOxM2稳定性的影响图中A对应的是10min，画对应的是30min。具体实施例方式实施例1、易错PCR建立突变文库及突变基因的筛选易错PCR是在标准PCR条件的基础上进行以下修改以增加突变率(1) MgCl2浓度增加到7mM以稳定非互补的碱基对；(2) 加入0. 05-0. 5mM MnCl2以降低聚合酶对模板的特异性；(3) dCTP和dTTP的浓度增加到lmM以促进错误渗入；(4) DNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续；(5) PCR扩增时不需要进行热启动，循环结束也不要延长延伸时间。 事实上反应体系中的Mn"浓度高低与DNA聚合酶保真性能直接相关。可以通过调节Mn2+浓度来控制反应体系的突变频率。经过设置Mn2+浓度梯度，最终确定Mn2+浓度为0. lmM， 突变频率大约为每1Kb突变1-3个碱基。 艮口，易错PCR条件具体如下 反应体系组成为(50 uL体系)10 X buffer (不含Mg20 Mg2+ (25mM)Mn2+ (5mM) dCTP aOraM) dTTP (lOmM) dATP (10mM) dGTP (10mM) 上游引物(20uM) 下游引物(20uM) 模板 Taq酶 MiniQ水5.0" 14. OuL5. OuL 5. OuL l.OnL l.OliL 2. OuL 2.0uL 2. 5ng 1" 124反应程序94'C预变性3min94。C变性 30sec、56。C退火 lmin 30个循环72。C延伸 70sec」72。C延伸 10min其中所用模板SEQIDNO: 12所示的DNA片段，所用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由芽孢杆菌基因ｓｏｘ改造成的蛋白质，其特征在于：具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５其中任意一个所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马晓航，郭康平，李霞，开雷，王磊，卢红波，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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