一种鉴定全叶延胡索的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。属于利用分子生物学方法鉴定全叶延胡索的技术领域。本发明专利技术提供了全叶延胡索（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ　ｒｅｐｅｎｓ）的特异性核苷酸序列及来源于该序列的核酸分子探针，以及利用该探针鉴别全叶延胡索的方法。本发明专利技术鉴别方法所用的样品量少，仅需少量样品就可以完成整个操作，鉴别准确、灵敏度高，为延胡索药材道地性的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上全叶延胡索和延胡索混杂的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于利用分子生物学方法鉴定全叶延胡索的
，具体地说， 是涉及一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。
技术介绍
元胡是著名中药"浙八味"中的一味，目前一般元胡正品指延胡索(Cbo^ato)，此外同属的一些其它植物在一些地区亦代替元胡入药， 但价格和药效均与元胡有较大差别。其中全叶延胡索为最常见的代替品和原材 料市场上的混淆品。目前，中药材种植上存在品种混乱问题，原材料市场上存 在品质优劣问题。仅仅依靠传统的形态分析已不能进行品种的科学鉴定和种源 的遗传分析。但是还没有一种可靠有效的方法可以将全叶延胡索与延胡索区分 开来，解决药材道地性问题。近年来，随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展 和打入国际市场的瓶颈。药用植物或植物药的发展离不开标准化生产，即0前 大力推行的GAP(Good agriculturing Practice,中药材生产质量管理规范) 工作的核心。而种(品)质的标准及科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的 前提。迄今为止，国际上有关延胡索植物化学、药用价值等方面的研究已有不少 报导，但是尚未见有关延胡索药材道地性DNA快速鉴定的技术的研究报导。因 此，有必要在DNA分子标记水平采用新方法新技术快速将延胡索的最常见混淆 品全叶延胡索从中鉴定出来，解决中草药种植上品种混乱和原材料市场上品质 优劣等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列，该序列来源于 ISSR通用引物UBC836扩增所得的全叶延胡索特异性核苷酸序列，具体序列为 SEQ NO 1:caaaagaggaaBgttggtgttcatatagcacaagacaatgaagatgaagaggattatatgggtgtag ggcctctgaatgaaaagctcgagaaggaaaagttgaagaatagtggggaactcgatgcatattagga gcccacagattctgaaagtgaagatgatgagagattctcatctgatgagttgaagaaacgatcggat gagttcgagaagaagttcaaactgcacgaagagttgcttaagaacttcactgatgtcggtaatggatctacatttctgtttaa犯cttg3agcatattttcataaataaattgaacaaatccatatacagaact atactgtgtttgcttttcatgaacttctttaattgggtgggttccctttgttgtatctttttttctc ctgatatgaactctcagtatgggctttatatcaaatggagaattgtgatttaatttgcatagctttt cccatttggattggtttattactttagttctccaacattaatcgctaaacaatctaaactgatgcat ttttctccactttac。核酸分子探针禾口方法
本专利技术的另一个目的是提供全叶延胡索专一性核酸分子探针，该核酸分子 探针来源于所述的SEQ NO 1核苷酸序列中的1段或2段23或20个核苷酸的 长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且 其核苷酸变化量不超过10%的序列。核酸分子探针的核苷酸序列为 R印ens31:5， -gcatcagtttagattgtttagcg-3， 或Repens32:5， -tatgggtgtagggcctctga_3'或者为R印ens31禾口 R印ens32。本专利技术的再一个目的是鉴定全叶延胡索的方法，是采用PCR方法，以所述 的核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进 行。所说的核酸分子探针为R印ens31和R印ens32。 本专利技术的有益效果是1) 样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。2) 准确、灵敏度高，R印ens31/R印ens32为全叶延胡索的专一性分子探针，若为延胡索，为阴性反应。由于本专利技术所提供的核酸分子探针为全叶延胡索专一性探针，因此，在样 品种源未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，鉴 定出其是否为全叶延胡索，为延胡索药材道地性的鉴定提供了客观、快速、 准确的方法，解决了药材市场上全叶延胡索和延胡索混杂的问题。 附图说明图l是采用ISSR引物UBC836进行PCR扩增的电泳图(a所指的条带是全 叶延胡索特有的条带，分子量为600bp左右)；图中l-6为栽培延胡索，7-11 为野生延胡索，12-16为全叶延胡索。M:分子量。图2是采用全叶延胡索专一性核酸分子探针R印ens31和R印ens32对全叶 延胡索进行检测的PCR扩增电泳图；M:分子量。图3是采用全叶延胡索专一性核酸分子探针R印ens31和R印ens32对延胡 索进行检测的PCR扩增电泳图；M:分子量。 具体实施方法本专利技术可以从遗传本质上客观准确地鉴定全叶延胡索。具体包括l.提供用于全叶延胡索鉴定的DNA片段；2.提供来源于上述DNA片段的全叶延胡索专 一性核酸分子探针；3.提供利用上述核酸分子探针鉴定全叶延胡索的方法。在采用ISSR分子标记研究延胡索和全叶延胡索遗传多样性时发现，ISSR 通用引物UBC836扩增的带型中，全叶延胡索有特异性条带，能将其与延胡索 区别开。因此，可根据此特异性条带合成专一性的核酸分子探针，建立快速、 准确鉴定全叶延胡索的分子生物学方法，用于延胡索药材道地性的检测。本专利技术提供的用于鉴别全叶延胡索的核苷酸序列来源于采用ISSR通用引 物UBC836扩增所得的全叶延胡索的特异性序列，该序列的结构特征如序列表 中的序列1 (<210〉1)所示。该序列(<210〉1)可通过如实施例l所述的方法得到；或者按已知的该序 列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。本专利技术的全叶延胡索专一性核酸分子探针是以上述全叶延胡索特异性核 苷酸序列为基础，利用Primer Primer 5. 0 (Vinay Singh, 1998)软件设计得 出。该分子探针为全叶延胡索特异性核苷酸序列中的1段或2段23或20个核 苷酸组成的寡核苷酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列再经修饰、 变化，且其核苷酸变化量不超过总核苷酸量的10%的序列。。本专利技术的上述全叶延胡索专一性核酸分子探针为序列表中〈210〉2和 <210〉3所示的序列(分别简称为R印ens31和R印ens32)。本专利技术的上述全叶延胡索专一性核酸分子探针，可按照预先根据全叶延胡 索特异性核苷酸序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例 如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。本专利技术的上述全叶延胡索专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与 全叶延胡索专一性反应，但不与延胡索的DNA发生反应。所以，利用该核酸分 子探针，通过PCR方法可以快速、准确地鉴别全叶延胡索。本专利技术所提供的全叶延胡索的鉴定方法，可采用PCR方法以前面所述的 本专利技术的核酸分子探针(优选为R印ens31和R印ens32)为PCR引物，进行PCR 反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行按照经过优化的PCR体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列，其特征是具有ＳＥＱ　ＮＯ　１的序列，该序列来源于ＩＳＳＲ通用引物ＵＢＣ８３６扩增所得的全叶延胡索特异性核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈川，赵云鹏，宗敏，陈炳龙，傅承新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]