用于无脉络膜的基因疗法的AAV载体制造技术

本发明专利技术涉及无脉络膜的治疗或预防的基因疗法。本申请公开了腺相关病毒血清型2(AAV2)载体颗粒，其包含AAV基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。本发明专利技术还公开了AAV2载体颗粒在治疗或预防无脉络膜中的应用。

AAV vector for non choroidal gene therapy

The present invention relates to gene therapy for the treatment or prevention of choroidal membrane. The present application discloses the adeno-related virus serotype 2 (AAV2) carrier particles, which contain the AAV genome or its derivatives and the sequence of the polynucleotide of the encoded REP1 or its variant. The invention also discloses the application of AAV2 carrier particles in the treatment or prevention of choroidal membrane.

【技术实现步骤摘要】
用于无脉络膜的基因疗法的AAV载体本申请是专利技术名称为“用于无脉络膜的基因疗法的AAV载体”、申请号为“201280019547.5(PCT/GB2012/050376)”、申请日为2012年2月21日的申请的分案申请。专利
本专利技术涉及无脉络膜的治疗或预防的基因疗法。专利技术背景无脉络膜是罕见的眼的脉络膜、视网膜色素上皮和感光器的X连锁渐进变性。受扰男性中的典型自然史是青少年时期开始夜盲症，然后在20多岁和30多岁期间渐进地丧失周边视觉，导致在40多岁完全失明。女性携带者具有轻的症状，大多数患有显著的夜盲症，但可偶尔具有更严重的表型。该疾病由REP1基因(Rab护卫蛋白1)中的突变引起，该基因位于X染色体21q区。在身体的大多数细胞中，REP2蛋白——与REP175％同源——补偿REP1缺乏。然而，在眼中，由于尚不清楚的原因，REP2不能补偿REP1缺乏。因此在眼中REP多肽活性不足以保持靶蛋白(RabGTP酶)的正常异戊烯化——导致细胞功能障碍和最终死亡，主要影响外部视网膜和脉络膜。不存在针对无脉络膜的治疗，并且缺少评价治疗策略的模型。存在提供这样的疗法的需要。专利技术概述本专利技术涉及载体，其可用于无脉络膜的基因疗法，和利用载体预防或治疗该疾病的方法。本专利技术还涉及载体在预防或治疗无脉络膜的方法中的应用。本专利技术的载体是病毒载体，具体地基于腺相关病毒(AAV)的基因组。载体包括编码REP1或其变体的序列，因此考虑在靶细胞中表达REP1功能。本专利技术的方法和应用特别涉及通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将载体施用给患者以治疗或预防无脉络膜。相应地，本专利技术提供载体，其包含腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。本专利技术进一步提供在需要其的患者中治疗或预防无脉络膜的方法，包括将治疗有效量的根据在前权利要求中任一项的载体通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射施用给所述患者，和由此在所述患者中治疗或预防无脉络膜。本专利技术另外提供通过直接的视网膜、视网膜下或玻璃体内注射将所述载体施用给患者的本专利技术的载体在治疗或预防无脉络膜的方法中的应用。附图简述图1显示AAV.REP1(AAV-CAG-REP1)载体可有效地转导从患有无脉络膜(Chm)的患者分离的人成纤维细胞。人REP1蛋白(hREP1)表达的相对水平通过蛋白质印迹来比较，允许通过比较不同浓度细胞裂解物中hREP1的量进行AAV2.REP1载体活性定量。关于标记，CAG是具有CMV增强子启动子序列的鸡β肌动蛋白——在各种出版物和该文件的部分中可互换地称作‘CBA’。左侧的图显示REP1的蛋白质印迹(上面的图)和作为荷载对照的α-微管蛋白的蛋白质印迹(下面的图)。泳道1：40μg来自对照野生型(WT)成纤维细胞的细胞裂解物。泳道2：40μg来自Chm成纤维细胞的细胞裂解物。泳道3-6：40、20、10和5μg来自用AAV2.REP1载体转导的Chm成纤维细胞的细胞裂解物。泳道7：人REP1重组蛋白。由于5μg裂解物hREP1带具有与40μgWT成纤维细胞裂解物相似的密度，所以用AAV2.REP1载体获得的hREP1水平可达到在这些条件下正常的野生型水平的至少8倍(40/5)。作为该试验中启动子和其它非REP1序列的阳性对照，还显示来自表达绿色荧光蛋白(GFP)代替REP1的对照AAV载体(AAV-CAG-GFP)的结果。右侧的图显示GFP的蛋白质印迹(上面的图)和作为荷载对照的α-微管蛋白的蛋白质印迹(下面的图)。泳道1：40μg来自野生型(WT)成纤维细胞的细胞裂解物。泳道2：40μg来自用AAV2.GFP载体(AAV-CAG-REP1)转导的Chm成纤维细胞的细胞裂解物。显示的高水平GFP证实该载体表达盒在转导缺乏REP1活性的人细胞中的有效性，其将是患有无脉络膜的患者中的情况。图2显示WT人成纤维细胞(左侧第一个柱-浅灰色)、Chm成纤维细胞(第二个柱-深灰色)、AAV-CAG-GFP载体-转导的Chm成纤维细胞(第三个柱-白色，阴性对照)和AAV-CAG-REP1转导的Chm成纤维细胞(第四个柱-白色)中异戊烯化活性的评估。y轴显示以pmol表示的转移的放射性标记的底物[3H]GGPP底物的量，其是异戊烯化的测量结果，REP1的功能。柱显示误差条为标准差(对于每个柱，n＝4)。在10mg蛋白提取物中测量[3H]-GGPP的水平。从左侧起第四个的青色柱证实用AAV.REP1载体转导之后，异戊烯化的功能还被恢复到野生型水平和超过野生型水平。这证实图1中蛋白质印迹检测的REP1蛋白具有预期的功能。图3显示在小鼠模型中视网膜下注射之后，AAV载体具有外部视网膜(感光器和脉络膜)的细胞的正确向性。右侧的图显示在小鼠眼中视网膜下注射AAV2.CBA.GFP.WPRE.BGH载体之后，外核层(ONL)和视网膜色素上皮(RPE)的感光器中绿色荧光蛋白(GFP)标记(箭头)的适当表达。左侧的图显示相同图像的灰度。这证实AAV2.CBA.WPRE.BGH调节序列能在无脉络膜的患者中需要被靶向的视网膜细胞中高度有效的转基因表达。图4显示AAV.REP1载体在小鼠视网膜中在高剂量下没有不利地影响外部视网膜功能。显示毒性研究的结果，其中在2×1微升的八个高剂量(n＝5)或低剂量(n＝4)AAV.REP1载体视网膜下注射到小鼠视网膜下空间之后六个月视网膜电图(ERG)的测量结果。低剂量＝1×1011和高剂量＝1×1012基因组颗粒(gp)/ml(人临床试验的起始剂量是1×1011gp/ml)。AAV.GFP载体具有相同的表达盒和在注射之前也稀释到相同剂量以充当对照。Y轴显示以从上面的暗适应(暗适应的)杆反应到明亮的到下面的明适应反应(其还将包括锥感光器)的范围渐增的闪光强度的ERG踪迹。在所有点的踪迹显示高剂量和低剂量AAV.REP1暴露之后相似的ERG振幅。在高剂量组中相等的GFP振幅被轻微地减低，与已知的在高水平下对GFP的视网膜功能的边缘效果一致。该GFP作用还充当阳性对照以证实该试验的灵敏度。序列的描述SEQIDNO：1是AAV2基因组的DNA序列。SEQIDNO：2是编码人Rep-1蛋白，转录物变体1的DNA序列。SEQIDNO：3是人Rep-1蛋白，转录物变体1的氨基酸序列。SEQIDNO：4是编码人Rep-1蛋白，转录物变体1的DNA序列，其包括5’UTR部分。SEQIDNO：5是土拨鼠肝炎后调节元件(WPRE)的DNA序列。SEQIDNO：6是鸡β肌动蛋白(CBA)启动子的DNA序列。SEQIDNO：7是来自牛生长激素的多聚腺苷酸化位点的DNA序列(bGH多聚A)。SEQIDNO：8是AAV2的5’反向末端重复(ITR)的DNA序列。SEQIDNO：9是AAV2的3’ITR的DNA序列。专利技术详述本专利技术提供无脉络膜的治疗。这是基于疾病的基因治疗方法，利用基因构建物递送转基因以恢复REP1功能。基因构建物是基于腺相关病毒(AAV)基因组的载体，其包含编码REP1或其变体的多核苷酸序列。该多核苷酸序列在本文也被称作“转基因”。本专利技术人建立了评价无脉络膜治疗策略的模型和令人惊讶地显示本专利技术的载体靶向引起疾病的细胞功能障碍的应用。载体AA本文档来自技高网...

【技术保护点】
腺相关病毒血清型2(AAV2)载体颗粒，其包含AAV基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2011.02.22 GB 1103062.41.腺相关病毒血清型2(AAV2)载体颗粒，其包含AAV基因组或其衍生物和编码REP1或其变体的多核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的载体颗粒，其中所述AAV基因组来自AAV的天然衍生的血清型或分离群或进化枝。3.根据权利要求2所述的载体颗粒，其中所述基因组是AAV2基因组或其衍生物。4.根据权利要求3所述的载体颗粒，其包含SEQIDNO：1或其衍生物。5.根据在前权利要求中任一项所述的载体颗粒，其中所述多核苷酸序列编码与SEQIDNO：3在其全部序列中具有至少70％同源性的多肽。6.根据权利要求5所述的载体颗粒，其中所述多核苷酸序列与SEQIDNO：2在其全部序列中具有至少70％的同源性。7.根据在...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·麦克拉伦，M·塞亚夫拉，M·J·杜日能，
申请(专利权)人：牛津大学创新公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB