一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法技术

本发明专利技术公开了一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：(a)将目的蛋白的编码基因分别克隆到成对的BiFC表达载体中，得到两个重组表达载体；所述目的蛋白为能够在植物细胞膜上形成同源二聚体的任何蛋白；(b)将所述两个重组表达载体导入到受体植物的叶片中；(c)利用TIRFM显微镜对所述受体植物的叶片进行观察。本发明专利技术提供了一种简单、快速观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布的方法。本方法具有以下优点：操作简单、快速；结果准确、清晰；重复性好；适用范围广：本方法适用于观察分析所有植物细胞膜上蛋白同源二聚体的分布情况。

A method to observe the distribution of protein homopolymer on the membrane of plant cells

The invention discloses a method of observing the distribution of protein homologous two polymer on the membrane of plant cell. The method provided by the invention comprises the following steps: (a) the gene encoding protein were cloned into BiFC expression vector pairs, two recombinant expression vector; the purpose is to gather any protein homology two protein body formation in plant cell membrane; (b) the two the recombinant expression vector into the receptor plant leaves; (C) using TIRFM microscope on the leaves of receptor plants were observed. The present invention provides a simple and rapid method to observe the distribution of protein homopolymer on the membrane of plant cells. The method has the following advantages: simple and rapid operation, accurate and clear results, good reproducibility and wide application: this method is suitable for observing and analyzing the distribution of protein homologous two polymers on all plant cell membrane.

【技术实现步骤摘要】
一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法。
技术介绍
细胞膜上蛋白之间可以相互作用形成寡聚体，这种寡聚化状态对维持细胞信号转导具有十分重要的作用。其中，同源二聚体尤为重要。因此，对细胞膜上存在的同源二聚体分布的观察十分必要。全内反射荧光显微术(TotalInternalReflectionFluorescenceMicroscopy,TIRFM)在观察细胞膜蛋白分布和运动中有着重要的地位，这种技术只激发距细胞膜表面100-300nm范围内的荧光基团，从而排除了其他荧光信号可能产生的干扰，增强了荧光显微镜在Z轴的分辨率。基于这一技术，科学家专利技术了全内反射荧光显微镜。已有研究报道了TIRFM可以观察细胞膜上单个蛋白质的分布。但是尚未有报道应用该技术观察植物细胞膜上同源二聚体蛋白的分布情况，原因在于植物含有细胞壁并且标记同源二聚体困难等种种原因。部分荧光蛋白可以分成两段，这两段分别与两个蛋白相连形成融合蛋白，当连接的两个蛋白相互作用时，荧光蛋白的两段相互靠近，恢复荧光活性，从而发光。这一技术即双分子荧光互补技术(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法。本专利技术所提供的观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法，可包括如下步骤：(a)将目的蛋白的编码基因分别克隆到成对的BiFC表达载体中，得到两个重组表达载体；所述目的蛋白为能够在植物细胞膜上形成同源二聚体的任何蛋白；(b)将所述两个重组表达载体导入到受体植物的叶片中；(c)利用TIRFM显微镜对所述受体植物的叶片进行观察。进一步地，步骤(a)中，所述成对的BiFC表达载体为成对的BiFC植物双元表达载体。其中，一个携带荧光蛋白的N端的编码基因，另一个携带所述荧光蛋白的C端的编码基因。所述荧光蛋白的N端的编码基因和所述荧光蛋白的C端的编码基因分别与所述目的蛋白的编码基因融合成两个融合基因；当两个融合基因所表达出的两个融合蛋白相互作用(即目的蛋白能够形成同源二聚体)时，荧光蛋白的两段相互靠近，恢复荧光活性，从而发光。在本专利技术的一个实施例中，所述荧光蛋白具体为YFP，启动子为CaMV35S启动子，终止子为NOS终止子。更加具体的，所述成对的BiFC表达载体为pNYE和pCYE。进一步地，步骤(b)中，所述“将所述两个重组表达载体导入受体植物的叶片”可按照包括如下步骤的方法实现：(b1)将所述两个重组表达载体分别转化至农杆菌感受态细胞中，得到两种重组农杆菌；(b2)向所述两种重组农杆菌中分别加入农杆菌侵染缓冲液，调节OD600为0.1～0.3，得到两种侵染菌液；(b3)将所述两种侵染菌液等体积混合，用无针头注射器(规格可为1ml)吸取后抵住所述受体植物叶片背面进行注射，从而实现将所述两种重组表达载体导入所述受体植物的叶片。更进一步地，在步骤(b1)中，所述两个重组表达载体可通过热激法或者电击法转化至所述农杆菌感受态细胞中。更进一步地，在步骤(b1)中，将所述两个重组表达载体分别转化至所述农杆菌感受态细胞中后还包括应用PCR技术筛选阳性克隆农杆菌，并培养至农杆菌生长对数期后收集农杆菌的步骤。更加具体的，所述农杆菌感受态细胞可为GV3101、LBA44044、EHA105或AGL1。进行所述培养时所用的农杆菌培养液具体可为LB培养液(配方：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl10g/L；pH7.0)。更进一步地，在步骤(b2)中，所述农杆菌侵染缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度为：0.5g/100mlD-葡萄糖，50mMMES，2mMNa3PO4·12H2O，pH5.4。进一步地，在步骤(b)中，将所述两个重组表达载体导入所述受体植物的叶片后，还可包括对所述受体植物培养24-36小时的步骤。具体的培养条件可为16小时光照/8小时黑暗，22℃恒温。进一步地，步骤(c)中，所述“利用TIRFM显微镜对所述受体植物的叶片进行观察”可按照包括如下步骤的方法实现：用剪刀在注射器浸染孔处剪取0.5-1cm2的所述受体植物的叶片，制片，样片放置于TIRFM显微镜上，并调节至激发光呈全内反射条件，之后进行观察。进一步地，所述受体植物可为双子叶植物或单子叶植物。更进一步地，所述双子叶植物具体可为烟草或拟南芥。所述烟草具体可为本生烟草(Nicotianabenthamiana)或者普通烟草(Nicotianatobacum)。在本专利技术的一个实施例中，所述目的蛋白具体为拟南芥HIR1蛋白。在本专利技术的另一个实施例中，所述目的蛋白具体为拟南芥Rem1.3蛋白。所述拟南芥HIR1蛋白的氨基酸序列同SEQIDNo.1所示DNA分子编码所得序列；所述拟南芥Rem1.3蛋白的氨基酸序列同SEQIDNo.2所示DNA分子编码所得序列。在本专利技术的一个实施例中，步骤(c)中所用的TIRFM显微镜具体为Olympus公司的IX-83型倒置显微镜，所用镜头为数值孔径NA1.45的100倍油镜，采集器为2台Andor公司的电子倍增电荷耦合器(Electron-MultiplyingCCD)相机，采集软件为MetaMorph。所用载波片和盖玻片购自德国Deckglaser公司。装片过程：把取下的叶片放到载玻片上，然后滴加一滴水，盖上盖玻片。观察过程：把样品至于显微镜下，调节激发光的入射角度直至全反射，采集图像。本专利技术提供了一种简单、快速观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布的方法。本方法具有以下优点：1)操作简单、快速：方法简单，由于是瞬时表达基因，因此花费时间短；2)结果准确、清晰：应用BiFC清晰标记细胞膜蛋白同源二聚体，TIRFM成像提高了Z轴分辨率，图像更清晰；3)重复性好：本方法可以达到100％的成功率；4)适用范围广：本方法适用于观察分析所有植物细胞膜上蛋白同源二聚体的分布情况。附图说明图1为拟南芥HIR1蛋白和Rem1.3蛋白形成的同源二聚体在细胞膜上分布的观察结果。A和B为TIRFM观察HIR1蛋白同源二聚体在烟草细胞膜上分布情况。C和D为TIRFM观察Rem1.3蛋白同源二聚体在烟草细胞膜上分布情况。A和B为不同视野，C和D为不同视野。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所观测的同源二聚体蛋白相关信息可以在拟南芥信息资源网(http://www.arabidopsis.org/)查找。BiFC表达载体pNYE和pCYE：这个两个载体及其具体构建方法均记载于“王丰青,张重义,童治军等.应用双分子荧光互补(BiFC)方法分析烟草中介体亚基之间的互作.农业生物技术学报,2012,20(1):38-47”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本专利技术实验使用。下面以拟南芥蛋白HIR1和Rem1.3为例，对本专利技术的观察方法进一步详细说明，但并不限制本专利技术。实施例1、拟南芥HIR1蛋白形成的同源二聚体在细胞膜上分布的观察1、HIR1表达载体构建应用高保真Taq酶(Pfu)通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法，包括如下步骤：(a)将目的蛋白的编码基因分别克隆到成对的BiFC表达载体中，得到两个重组表达载体；所述目的蛋白为能够在植物细胞膜上形成同源二聚体的任何蛋白；(b)将所述两个重组表达载体导入到受体植物的叶片中；(c)利用TIRFM显微镜对所述受体植物的叶片进行观察。

【技术特征摘要】
1.一种观察植物细胞膜上蛋白同源二聚体分布情况的方法，包括如下步骤：(a)将目的蛋白的编码基因分别克隆到成对的BiFC表达载体中，得到两个重组表达载体；所述目的蛋白为能够在植物细胞膜上形成同源二聚体的任何蛋白；(b)将所述两个重组表达载体导入到受体植物的叶片中；(c)利用TIRFM显微镜对所述受体植物的叶片进行观察。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述成对的BiFC表达载体为成对的BiFC植物双元表达载体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述“将所述两个重组表达载体导入受体植物的叶片”是按照包括如下步骤的方法进行的：(b1)将所述两个重组表达载体分别转化至农杆菌感受态细胞中，得到两种重组农杆菌；(b2)向所述两种重组农杆菌中分别加入农杆菌侵染缓冲液，调节OD600为0.1～0.3，得到两种侵染菌液；(b3)将所述两种侵染菌液等体积混合，用无针头注射器吸取后抵住所述受体植物叶片背面进行注射，从而实现将所述两种重组表达载体导入所述受体植物的叶片。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤(b1)中，所述两个重组表达载体是通过热激法或者电击法转化至所述农杆菌感受态细胞中的；和/或在步骤(b1)中，将所述两个重组表达载体分别转化至所...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，李瑞丽，玉猛，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11