用于心肌细胞分离提纯的试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒及使用方法，涉及生物细胞培养技术领域，试剂盒包括第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物，其中：第一试剂混合物包括7.012‑8.007份Nacl，0.395‑0.403份Kcl，0.123‑0.222份MgSO4.7H2O，0.973‑1.046份葡萄糖，0.060‑0.077份KH2PO4，0.042‑0.071份Na2HPO4，4.766‑5.958份4‑羟乙基哌嗪乙磺酸；第二试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；第三试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1。采用本发明专利技术的试剂盒进行心肌原代细胞分离提纯，大大缩短心肌细胞提纯耗时。且心肌细胞与非心肌细胞分离效果更佳，心肌细胞纯度更高。

A kit for isolation and purification of cardiac myocytes and its application

The invention discloses a kit for isolation and purification of myocardial cells and the use of methods involving biological cell culture technology, kit includes a first reagent mixture, second reagent mixture and third reagent mixture, wherein the first reagent mixture including 7.012 8.007 Nacl, 0.395 Kcl 0.123 0.403 copies, 0.222 copies of MgSO4.7H2O. 0.973 1.046 glucose, 0.060 0.077 KH2PO4, 0.042 0.071 Na2HPO4, 4.766 5.958 4 HEPES; second reagent mixture including ultrapure water, Percoll solution and buffer solution, the volume ratio of 1:3:1; third reagent mixture including ultrapure water, Percoll solution and buffer solution, the volume ratio 2:2:1. The reagent box of this invention is used to separate and purify cardiac myocytes, which greatly reduces the time of purification of cardiac myocytes. The isolation effect of myocardial cells and non myocardial cells is better, and the purity of cardiac myocytes is higher.

【技术实现步骤摘要】
用于心肌细胞分离提纯的试剂盒及使用方法
本专利技术涉及生物细胞培养
，具体涉及一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒及使用方法。
技术介绍
各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，目前的工具鼠多为小鼠背景，而心肌细胞水平的研究多采用大鼠乳鼠心肌细胞，相较于大鼠心肌原代细胞的分离纯化技术及比较成熟的H9C2细胞系体系，小鼠心肌原代细胞的分离纯化明显不足。目前心肌原代细胞分离方法多采用胰酶胶原酶联合消化或单一胶原酶消化，心肌细胞纯化多采用差速贴壁法。采用胰酶胶原酶联合消化的缺陷是：胰酶对心肌细胞有一定的损伤极大地影响了心肌细胞的存活率，当前虽极力减少细胞与胰酶的接触时间及减少胰酶的消化时间，但对心肌细胞存活率的影响依然存在，这在小鼠心肌原代分离纯化过程中尤为明显。采用单一胶原酶消化的缺陷是：虽然胶原酶作用较缓和，对细胞损伤较小，但后期需用化学抑制剂(如5-溴脱氧尿嘧啶)抑制成纤维细胞生长以期纯化心肌。在小鼠心肌原代细胞培养中依然存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷，且化学抑制剂的存在是否影响心肌细胞的功能，尚有待证明，且化学抑制剂的存在将增加实验本身的影响因素，使结果出现难以预计的偏倚。同时，采用差速贴壁法进行心肌原代细胞分离纯化的过程普遍需要3-3.5小时，纯度、存活率在90％左右，且难以同时兼顾纯度和存活率两个方面。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒及使用方法，细胞存活率高、纯度高。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物，其中：所述第一试剂混合物包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO4.7H2O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH2PO4，0.042-0.071份Na2HPO4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸；所述第二试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；所述第三试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；所述第二试剂混合物和第三试剂混合物中的缓冲液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO4.7H2O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH2PO4，0.213-0.365份Na2HPO4，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。在上述技术方案的基础上，所述第一试剂混合物用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。在上述技术方案的基础上，所述缓冲液还包括超纯水和NaOH，所述缓冲液用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。在上述技术方案的基础上，所述第一试剂混合物为粉末或溶液。本专利技术还公开了一种所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法：S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；S2，使用第一试剂混合物配制心肌缓冲液，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；S7，使用第二试剂混合物和第三试剂混合物配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO2温箱中培养。在上述技术方案的基础上，使用所述第二试剂混合物和所述第三试剂混合物按体积比4:5配制所述密度梯度液。在上述技术方案的基础上，所述密度梯度液配制方法为：将第二试剂混合物悬空滴加入离心管中，再缓慢加入第三试剂混合物。在上述技术方案的基础上，所述包被液为层粘连蛋白包被液、多聚赖氨酸包被液和明胶包被液中的一种。在上述技术方案的基础上，所述层粘连蛋白包被液由1ug/ul层粘连蛋白于磷酸盐第一试剂混合物中稀释至10ug/ml制成。在上述技术方案的基础上，所述明胶包被液由明胶溶于水中配制而成，其中明胶浓度为1.5％。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)采用本专利技术的试剂盒进行心肌原代细胞分离提纯，由于采用第二试剂混合物和第三试剂混合物配成的密度梯度液使心肌细胞与非心肌细胞分离仅需要35min，相比传统做法采用差速贴壁法使心肌细胞与非心肌细胞分离需要90min，大大缩短心肌细胞提纯耗时。且心肌细胞与非心肌细胞分离效果更佳，心肌细胞纯度更高。(2)采用本专利技术的试剂盒进行心肌原代细胞分离提纯，第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物均不含有胰酶或添加化学抑制剂，避免了胰酶化学抑制剂对心肌细胞的损伤，且第一试剂混合物为低钙试剂，适宜于保持心肌细胞活性，因此，采用本专利技术的试剂盒可最大程度上保证了心肌细胞的活性，细胞存活率更高。附图说明图1为本专利技术实施例中用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法的流程示意图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的实施例作进一步详细说明。参见图1所示，本专利技术实施例提供一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，试剂盒包括第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物，其中：第一试剂混合物包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO4.7H2O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH2PO4，0.042-0.071份Na2HPO4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸；第一试剂混合物还包括超纯水和NaOH，第一试剂混合物用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5；第一试剂混合物为粉末或溶液。第二试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；第三试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；第二试剂混合物和第三试剂混合物中的缓冲液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO4.7H2O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH2PO4，0.213-0.365份Na2HPO4，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。采用本专利技术的试剂盒进行心肌原代细胞分离提纯，由于采用第二试剂混合物和第三试剂混合物配成的密度梯度液使心肌细胞与非心肌细胞分离仅需要35min，相比传统做法采用差速贴壁法使心肌细胞与非心肌细胞分离需要90min，大大缩短心肌细胞提纯耗时。且心肌细胞与非心肌细胞分离效果更佳，心肌细胞纯度更高。采用本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物，其中：所述第一试剂混合物包括7.012‑8.007份Nacl，0.395‑0.403份Kcl，0.123‑0.222份MgSO4.7H2O，0.973‑1.046份葡萄糖，0.060‑0.077份KH2PO4，0.042‑0.071份Na2HPO4，4.766‑5.958份4‑羟乙基哌嗪乙磺酸；所述第二试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；所述第三试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；所述第二试剂混合物和第三试剂混合物中的缓冲液包括35.064‑40.032份Nacl，1.975‑2.013份Kcl，0.615‑1.107份MgSO4.7H2O，4.865‑5.226份葡萄糖，0.301‑0.384份KH2PO4，0.213‑0.365份Na2HPO4，23.830‑29.788份4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。

【技术特征摘要】
1.一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物，其中：所述第一试剂混合物包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO4.7H2O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH2PO4，0.042-0.071份Na2HPO4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸；所述第二试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；所述第三试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；所述第二试剂混合物和第三试剂混合物中的缓冲液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO4.7H2O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH2PO4，0.213-0.365份Na2HPO4，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。2.如权利要求1所述的一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述第一试剂混合物用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。3.如权利要求1所述的一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液还包括超纯水和NaOH，所述缓冲液用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。4.如权利要求1所述的一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述第一试剂混合物为粉末或溶液。5.一种如权利要求1-4任意一项所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；S2，使用第一试剂混合物配制心肌缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：董念国，刘保庆，李飞，尚小珂，史峰，邱雪峰，史嘉玮，陈思，吴龙，刘隽炜，刘义华，胡行健，洪昊，李华东，孙永丰，乔韡华，张超，王寅，李庚，朱鹏，刘名，耿冰川，代金池，白鹏，姜烨凡，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42