一种心肌细胞分离提纯方法技术

本发明专利技术公开了一种心肌细胞分离提纯方法，涉及生物细胞培养技术领域，S1，将配好的包被液加入于六孔板中孵育；S2，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入离心管中，摇床培养，弃上清；S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；S7，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；S8，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后重悬，计数后加入步骤S1处理后的六孔板培养。

A method of isolation and purification of cardiac myocytes

【技术实现步骤摘要】
一种心肌细胞分离提纯方法
本专利技术涉及生物细胞培养
，具体涉及一种心肌细胞分离提纯方法。
技术介绍
各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，目前的工具鼠多为小鼠背景，而心肌细胞水平的研究多采用大鼠乳鼠心肌细胞，相较于大鼠心肌原代细胞的分离纯化技术及比较成熟的H9C2细胞系体系，小鼠心肌原代细胞的分离纯化明显不足。目前心肌原代细胞分离方法多采用胰酶胶原酶联合消化或单一胶原酶消化，心肌细胞纯化多采用差速贴壁法。采用胰酶胶原酶联合消化的缺陷是：胰酶对心肌细胞有一定的损伤极大地影响了心肌细胞的存活率，当前虽极力减少细胞与胰酶的接触时间及减少胰酶的消化时间，但对心肌细胞存活率的影响依然存在，这在小鼠心肌原代分离纯化过程中尤为明显。采用单一胶原酶消化的缺陷是：虽然胶原酶作用较缓和，对细胞损伤较小，但后期需用化学抑制剂(如5-溴脱氧尿嘧啶)抑制成纤维细胞生长以期纯化心肌。在小鼠心肌原代细胞培养中依然存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷，且化学抑制剂的存在是否影响心肌细胞的功能，尚有待证明，且化学抑制剂的存在将增加实验本身的影响因素，使结果出现难以预计的偏倚。同时，采用差速贴壁法进行心肌原代细胞分离纯化的过程普遍需要3-3.5小时，纯度、存活率在90％左右，且难以同时兼顾纯度和存活率两个方面。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种心肌细胞分离提纯方法，细胞存活率高、纯度高。为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种心肌细胞分离提纯方法，包括：S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；S2，配制心肌缓冲液，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；S7，配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO2温箱中培养。在上述技术方案的基础上，所述包被液为层粘连蛋白包被液、多聚赖氨酸包被液和明胶包被液中的一种。在上述技术方案的基础上，按质量份计，所述心肌缓冲液包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO4.7H2O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH2PO4，0.042-0.071份Na2HPO4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。在上述技术方案的基础上，所述心肌缓冲液还包括超纯水和NaOH，所述心肌缓冲液用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。在上述技术方案的基础上，所述密度梯度液由高密度液和低密度液配制而成，所述高密度液包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；所述低密度液包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；按质量份计，所述缓冲液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO4.7H2O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH2PO4，0.213-0.365份Na2HPO4，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。在上述技术方案的基础上，所述密度梯度液由高密度液和低密度液按体积比4:5配制而成。在上述技术方案的基础上，所述密度梯度液配制方法为：将所述高密度液悬空滴加入离心管中，再缓慢加入所述低密度液。在上述技术方案的基础上，步骤S8后，将提纯后的心肌细胞置于心肌细胞培养基中培养。在上述技术方案的基础上，所述心肌细胞培养基为浓度10％的胎牛血清。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术心肌原代细胞分离提纯过程采用密度梯度离心法提纯心肌细胞，采用差速贴壁法使心肌细胞与非心肌细胞分离需要90min，本专利技术采用密度梯度分层使心肌细胞与非心肌细胞分离仅需要35min，大大缩短心肌细胞提纯耗时。且心肌细胞与非心肌细胞分离效果更佳，心肌细胞纯度更高。(2)本专利技术采用胶原酶消化，避免了胰酶对心肌细胞的损伤；同时，由于采用密度梯度离心法提纯心肌细胞，后期无需添加化学抑制剂，避免了化学抑制剂对心肌细胞的损伤；且心肌缓冲液为低钙试剂，适宜于保持心肌细胞活性，因此，最大程度上保证了心肌细胞的活性，细胞存活率更高。附图说明图1为本专利技术实施例中心肌细胞分离提纯方法的流程示意图。具体实施方式以下结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细说明。参见图1所示，本专利技术实施例提供一种心肌细胞分离提纯方法，包括：S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；S2，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；S7，配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO2温箱中培养。步骤S8后，将提纯后的心肌细胞置于心肌细胞培养基中培养。心肌细胞培养基包括浓度10％的胎牛血清。A.包被液：包被液为层粘连蛋白包被液、多聚赖氨酸包被液和明胶包被液中的一种。层粘连蛋白包被液：将1ug/ul层粘连蛋白于磷酸盐心肌缓冲液中稀释至10ug/ml。明胶包被液：将明胶溶于水中配制浓度为1.5％的溶液。B.心肌缓冲液：按质量份计，心肌缓冲液包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO4.7H2O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH2PO4，0.042-0.071份Na2HPO4，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。心肌缓冲液用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。C.Ⅱ型胶原酶：0.05％Ⅱ型胶原酶和0.1％Ⅱ型胶原酶用上述心肌缓冲液配制而成。取0.05gⅡ型胶原酶，用心肌缓冲液定容至100ml，制成浓度为0.05％Ⅱ型胶原酶；取0.1gⅡ型胶原酶，用心肌缓冲液定容至100ml，制成浓度为0.1％Ⅱ型胶原酶。D.密度梯度液：密度梯度液由高密度液和低密度液按体积比4:5配制而成，高密本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌细胞分离提纯方法，其特征在于，包括：S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；S2，配制心肌缓冲液，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；S7，配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO2温箱中培养。

【技术特征摘要】
1.一种心肌细胞分离提纯方法，其特征在于，包括：S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；S2，配制心肌缓冲液，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；S7，配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO2温箱中培养。2.如权利要求1所述的一种心肌细胞分离提纯方法，其特征在于：所述包被液为层粘连蛋白包被液、多聚赖氨酸包被液和明胶包被液中的一种。3.如权利要求1所述的一种心肌细胞分离提纯方法，其特征在于：按质量份计，所述心肌缓冲液包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO4.7H2O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH2PO4，0.042-0.071份Na2HPO4，4.766...

【专利技术属性】
技术研发人员：董念国，刘保庆，李飞，尚小珂，史峰，邱雪峰，史嘉玮，陈思，吴龙，刘隽炜，刘义华，胡行健，洪昊，李华东，孙永丰，乔韡华，张超，王寅，李庚，朱鹏，刘名，代金池，白鹏，姜烨凡，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42