一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法及其应用技术

本发明专利技术属于动物细胞培养技术，涉及一种分选大鼠心成纤维细胞CD90

A method for the separation of CD90+ subsets of rat cardiac fibroblasts and its application

The invention belongs to the technique of animal cell culture, and involves a separation of rat cardiac fibroblast CD90

【技术实现步骤摘要】
一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法及其应用
本专利技术属于动物细胞培养技术，涉及一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法及其应用。
技术介绍
缺血性心脏病已成为威胁人类健康和生命的头号杀手，如何预防和治疗缺血性心脏病引起了极大关注。目前，修复受损心肌主要是补充或替代坏死的心肌细胞，同时阻止心肌纤维化。近年来，随着干细胞研究逐步深入，细胞移植被认为是一种极具临床应用前景的治疗缺血性心脏病的再生医学疗法。那么，除干细胞的定向修复外，可否调动心肌组织自身的、增殖能力较强的其他细胞，使其诱导分化为新的心肌细胞，从而使心功能得以有效改善，心成纤维细胞(CardiacFibroblasts,CFs)，数量巨大（占心肌组织细胞的60%），分布广泛，且抗缺氧损伤能力强，即使在长期纤维化状态下，仍具有较高的增殖和代谢活性，在心脏疾病发生、发展中起重要作用。由于心肌细胞增殖能力有限，尤其是在心肌受到损伤时，心肌细胞增殖的速度难于迅速满足恢复心功能的需要。越来越多的证据表明，诱导自体CFs向心肌细胞转化则是修复受损心肌的最直接和最有效途径之一。2006年，Takahashi和Yamanaka报道了将小鼠成纤维细胞，通过过表达四个关键转录因子Oct3/4，sox2，c-Myc和Klf4，可转化为诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPS）。2010年，Ieda等联合三种心脏发育转录因子Gata4、Mef2C和Tbx5(GMT)，体外将成纤维细胞诱导转化为心肌样细胞。2012年，两个不同研究团队在体内也验证了成纤维细胞可以直接重编程为心肌样细胞，并且，Song等除了使用GMT外，还加入第四种转录因子Hand2，大大提高了心成纤维细胞向心肌样细胞转化的效率。Wada等尝试Mesp1和Myocd，联合GMT，也可使成纤维细胞向心肌样细胞转化。培养细胞微环境改变也可提高成纤维细胞重编程效率，Wada等将转录因子组合重编程的成纤维细胞与心肌细胞共培养，发现诱导的心肌样细胞与原代培养心肌细胞间出现了同步收缩，表明可能在共培养的微环境中心肌细胞分泌的某些蛋白、细胞因子或者是电机械刺激促进了成纤维细胞的分化。前期研究发现，心肌急性梗死动物模型中，在梗死区和梗死边缘区，CFs可以表达cTnT，表明微环境中的某些物质可在成纤维细胞向心肌样细胞转变中起决定作用。已有研究表明，除小分子物质可以诱导成纤维细胞重编程为心肌细胞外，Deng等联合用维生素A酸（Retinoicacie，RA），二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）和5-aza诱导人胎儿肝间充质干细胞（Humanfetalliver-derivedmesenchymalstemcells，HFMSCs）向心肌样细胞转化。有大量研究发现5-aza可诱导骨髓间充质干细胞（Bonemarrow-derivedMSCs,BMSCs）和脐血间充质干细胞（humanumbilicalcord-derivedMSCs,hucMSCs）向心肌细胞分化。5-aza是一种DNA甲基化酶抑制剂，为胞嘧啶核苷的类似物，在DNA复制过程中可替代正常的胞嘧啶核苷酸形成新的DNA双链，可与DNA甲基转移酶共价结合，使酶活性降低，使细胞基因组DNA在复制中进行性去甲基化，激活表型特异的基因表达。也有研究证实，5-aza可使成纤维细胞向心肌细胞分化，汤成春等将体外培养CFs经5-aza诱导后，可检测到β-MHC的表达，移植入心肌梗死区及其周围区域，4w后通过电镜和免疫组化证实CFs转化为心肌样细胞。前期研究发现，在心肌损伤情况下，大鼠CFs可以表达心肌特有的肌钙蛋白（cTnT）和干细胞的标记物nanog。在体外培养状态下，部分CFs既表达nanog、也表达c-kit和sca-1等多种心肌干细胞标记物，同时也表达CD73和CD90等间充质干细胞表面标记，体外定向诱导可使其向成心肌、成神经、成骨和成脂分化，提示CFs可能是由不同的干细胞亚群组成，具有高度的幼稚性，在一定的条件下具备分化为心肌样细胞的潜能。因此，如果能将具有分化潜能的CFs转化为心肌细胞，不但可以减少对心脏的不利影响（如瘢痕等），而且可以高效增加心肌细胞数量，改善心功能。已有研究发现，CD90（Thy1）在其他组织成纤维细胞中也有表达，大鼠肺、心及人的眼眶和生殖道的成纤维细胞均可分为Thy1-群和Thy1+群，在细胞增殖和胶原合成上有显著差异，但CD90+CFs在向心肌细胞分化中，及其细胞移植后对心肌损伤的修复作用，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术为解决受损心肌修复的技术难题，公开了一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法及其应用。为解决上述技术难题，本专利技术采用以下技术方案：一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法，步骤如下：（1）复苏并扩大培养大鼠心成纤维细胞株；（2）用PE-标记CD90+抗体分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群；（3）收集分选的大鼠心成纤维细胞CD90+亚群，离心去上清后得细胞沉淀，接种细胞沉淀至培养瓶中，进行扩大培养，完成大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的分选。一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的应用，其特征在于：作为筛选心成纤维细胞优势亚群，调动心成纤维细胞修复心肌的应用，操作如下：（1）向分选的大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的细胞内，加入心肌细胞诱导分化液，诱导25-30天，制得CD90+心成纤维细胞悬液；（2）用DAPI标记大鼠心成纤维细胞CD90+悬液中的细胞核，结扎大鼠左冠状动脉前降支制备急性心肌梗死模型，待心电图确认模型制备成功30min后，把DAPI标记的细胞悬液，多点微量注射到心肌梗死边缘区肌层。所述心肌细胞诱导分化液为物质的量浓度13-18μmoL/L5-氮杂胞苷溶液。所述心肌细胞诱导分化液的最优物质的量浓度为15μmoL/L。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过流式细胞仪分选CD90+CFs群，扩大培养并经心肌化诱导后移植入急性心肌梗死模型大鼠梗死边缘区，小动物超声影像系统和病理切片检测修复心肌效果，将为筛选CFs优势亚群，调动CFs的心肌修复潜能，为高效利用CFs提供实验依据和理论支撑。附图说明图1为免疫组化检测细胞株成纤维细胞标记物表达；其中A为细胞骨架波形蛋白vimentin表达，B为盘状结构域蛋白DDR2表达，C为成纤维细胞特异蛋白FSP1表达；标尺：20μm。图2为CFs细胞株经CD90+免疫荧光染色图。图3为流式细胞仪检测并分选图。图4为细胞免疫荧光检测CD90+表达和细胞移植前DAPI标记图；其中A为白光下细胞形态，B为CD90+表达阳性细胞，C为A和B的叠加，D为CD90+细胞移植入心肌梗死模型前DAPI标记细胞；红色为Cy3标记的CD90+阳性细胞，蓝色为DAPI标记细胞核；标尺：50μm。图5为细胞免疫荧光检测CD90+心肌化诱导；其中A为细胞CD90阳性表达，Cy3标记，呈红色荧光；B为细胞cTnT阳性表达，FITC标记，呈绿色荧光；C为细胞核，DAPI标记，呈蓝色荧光；D示A、B和C叠加；标尺：50μm。图6为HE和Masson染色示心肌梗死区和梗死边缘区；其中左侧图表示HE染色，呈条索状，苏木素重染的区域为梗死本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分选大鼠心成纤维细胞CD90

【技术特征摘要】
1.一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的方法，其特征在于步骤如下：（1）复苏并扩大培养大鼠心成纤维细胞株；（2）用PE-标记CD90抗体分选心成大鼠纤维细胞CD90+亚群；（3）收集分选的大鼠心成纤维细胞CD90+亚群，离心弃上清后得细胞沉淀，接种细胞沉淀至培养瓶中，进行扩大培养，完成大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的分选。2.一种分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群的应用，其特征在于：作为筛选心成纤维细胞优势亚群，调动心成纤维细胞修复心肌的应用。3.如权利要求2所述的分选大鼠心成纤维细胞CD90+亚群分化的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：常玉巧，李辞霞，郭志坤，王现伟，贾阳阳，郭永龙，张俊悦，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41