一种制备高纯河豚毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化提取生产高纯河豚毒素的方法，其产品可用于戒毒、镇痛及降压药物制剂。解决了目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵（高压液相仪）的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题，提供了一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法工艺简单、高效，产率高，品质优良，产品纯度高于99.5%，直接符合生物学研究和临床应用的要求。本发明专利技术的另一目的是提供了含有本法制备的河豚毒素产品的各种制剂。

A method for the preparation of high purity tetrodotoxin

The invention relates to a method for large-scale production of purified tetrodotoxin by using puffer fish viscera as raw material, and its product can be used for detoxification, analgesia and antihypertensive drug preparations. To solve the current methods of extraction and purification of tetrodotoxin is various, but these methods are more or less there are some defects, such as high performance liquid chromatography with high purity of the output there are also expensive equipment (high pressure liquid chromatography) problems, and such as impregnation fractionation has lower efficiency, the product purity is not high, provides a method for large-scale extraction and preparation of tetrodotoxin, this method has the advantages of simple process, high efficiency, high yield, good quality, the product purity is higher than 99.5%, directly in line with the biological research and clinical application requirements. Another purpose of the present invention is to provide various preparations containing the tetrodotoxin product prepared by this method.

【技术实现步骤摘要】
一种制备高纯河豚毒素的方法
本专利技术涉及一种化学物质提取领域，尤其涉及一种以河豚鱼内脏为原料规模化、高效地提取生产高纯河豚毒素的方法。其产品可用于戒毒、镇痛及降压药物制剂。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种由河豚鱼内脏提取的低分子量生物碱类物质。由于其独特的化学结构使其成为细胞钠离子通道专一阻断剂。因此其在生物学研究领域作为生物试剂有着不可替代的位置。河豚毒素在医学临床上所显示的药理学作用，早在上世纪30年代就已有用于临床介断生物碱类成瘾性病症的报道。在镇痛治疗方面也不断有报道推出。因此，其无论在生物学研究领域还是在医学临床应用方面，都显示了十分重要的地位。TTX是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX的活性基团是1，2，3位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羟基，胍基在生理pH值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。钠离子受体至少有6个特异性靶分子结合位点，TTX是与钠通道受体部位I结合。TTX受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，TTX与受体部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。研究表明，TTX特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神经肌肉的突触及胆碱指酶无直接影响。此外，毒素能通过血脑屏障进入中枢，对中枢产生明显的抑制作用。总的来说，TTX对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。TTX由于在极微量的情况下就能阻断细胞钠离子的通道，而对钾离子通道没有影响，具有高度的转移性，因此是十分有用的神经生理研究用工具药。临床医学上已证明TTX是良好的镇静剂、解痉剂、镇痛剂，特别对癌症等恶性疼痛具有良好的镇痛作用，与传统的杜冷丁、吗啡等镇痛药相比虽然响应时间稍长，但其镇痛作用可达12-20小时，而且无成瘾性。近来TTX在戒毒方面也显示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射10μgTTX一针，5-7天为一个疗程，毒瘾即可得到控制，并可大大减轻一般戒毒中常常出现的戒毒综合症。但河豚毒素注射液(水溶液)对温度很敏感，容易受温度的影响而发生降解，温度越高，降解越快。一旦有效活性物质河豚毒素含量低于其标示量的90％或有关物质的相对含量超过医药标准规定限度(大于对照溶液主峰面积)就不符合临床使用要求。试验证明，河豚毒素注射液(水针剂)在室温下不稳定，为了保证河豚毒素注射液的质量，防止河豚毒素含量下降和有关物质含量升高，必须将其置于4-8℃冰箱中保存。这就给河豚毒素的临床适用带来诸多困难和不便，相应在贮存、运输、装卸、批发、零售、医院和应用各个环节都得注意保持4-8℃低温，否则温度偏高可能影响临床效果，对此，必须设法尽快予以解决，研制出安全稳定，室温下就能长期贮存的可靠产品。为了解决上述问题，一个简单的做法是将河豚毒素做成冻干制剂。一般在水溶液中不稳定的生物活性物质在冻干脱水后贮存期都可延长，待临床应用时，加灭菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于医药时，其每剂量的用量只有0.5-60μg，如此微量的河豚毒素在溶液中经冻干脱水后形成不了所要求的固态残留物，必需加入医药上能接受的赋形剂，才能提供微量河豚毒素得以附着的支架，在溶液冻干脱水后能形成固态物。虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题。中国专利局于2008年6月18日公开了一种河豚毒素制备方法的专利技术专利，授权公开号为CN101891751B，该专利技术专利采用氨基酸作助溶剂，不仅能起到助溶剂的作用，增加河豚毒素在水中的溶解性，还能与河豚毒素形成高水溶性的盐溶液，提供了一种生产纯度较高、杂质较少河豚毒素的方法，但该技术方案同样存在着制备周期过长、不宜用于大规模产业化生产等方面的缺陷。
技术实现思路
为解决上述虽然目前提取、提纯河豚毒素的方法繁多，但这些方法多多少少都存在着一定的缺陷，如产出纯度高的高效液相法也存在这设备昂贵(高压液相仪)的问题，又例如浸渍分馏法，存在着效率低下、产品纯度不高等问题，提供了一种能够大规模提取制备河豚毒素的方法，该方法工艺简单、高效，产率高，品质优良，产品纯度高于99.5％，直接符合生物学研究和临床应用的要求。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种制备高纯河豚毒素的方法，所述方法包括以下步骤：1)将河豚内脏捣碎、匀浆，倒入pH值为3.5-4.5的醋酸水溶液加热煮沸，冷却后加入与醋酸水溶液等体积的甲醇-水溶液，经200-300r/m转速搅拌后用筛绢过滤收集滤液，滤渣重复上述操作3-5次，将滤液合并后以板框压滤机压滤得到橙黄色毒液；2)橙黄色毒液浓缩脱脂后，在低温条件下以活性炭脱色纯化，滤出活性炭，再加入大孔吸附剂同时以90-120r/m转速搅拌进一步吸附纯化，反应30-35min，布氏漏斗抽滤得到浅黄色毒液；3)将浅黄色毒液通过阳离子交换树脂柱，至树脂吸附至饱和状态后以去离子水洗阳离子交换树脂柱，再以醋酸-醇-水体系溶液洗脱，收集洗脱液；4)对洗脱液进行冷冻干燥和减压浓缩，至洗脱液体积减少至原体积的1/3-1/4得到浓缩河豚毒素毒液，以纳滤膜对浓缩河豚毒素毒液进行纳滤收集滤液，再对滤液重复进行三次纳滤处理，得到无杂质河豚毒素毒液；5)将无杂质河豚毒素毒液通过交联葡聚糖凝胶柱，以去离子水洗交联葡聚糖凝胶柱，再用pH值为3-4的醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液得到液态河豚毒素粗品；6)向液态河豚毒素粗品中滴加氨水调节pH至9-10，优选调节pH至9.2-9.5，在低温减压环境下静置20-24h，得到河豚毒素粗品；7)将河豚毒素粗品溶于以醋酸-醇体系溶液溶解，再滴加氨水调节pH至9-10，优选调节pH至9.2-9.5，在低温减压环境下静置20-24h，得到所需河豚毒素。作为优选，步骤1)中甲醇-水溶液中甲醇含量为8-10％，筛绢孔径为350目。作为优选，步骤2)中所述低温为2-5℃；大孔吸附剂为D101大孔吸附剂或D201大孔吸附剂中的至少一种。作为优选，步骤3)醋酸-醇-水体系溶液中醇为甲醇或乙醇中的至少一种，醋酸含量为0.8-1.2％，醇含量为10-12％，余量为水。作为优选，步骤4)中纳滤所施外压为0.1-6MPa，纳滤膜孔径为1-10nm。作为优选，步骤4)中纳滤所施外压优选为0.2-0.3MPa，纳滤膜孔径为1-2nm。作为优选，步骤5)中交联葡聚糖凝胶柱型号为SephadexG-10、SephadexG-15、SephadexG-25、SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG-100、SephadexG-150和SephadexG-200中的任意一种。作为优选，步骤5)中交联葡聚糖凝胶柱型号优选为SephadexG-10。作为优选，步骤6)和步骤7)中所述低温为2-8℃，优选为2-5℃；低压为0.1-10Pa，优选为0.8-1.1Pa。上述方法是在加热煮沸醋酸水溶液的条件下提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）将河豚内脏捣碎、匀浆，倒入pH值为3.5‑4.5的醋酸水溶液加热煮沸，冷却后加入与醋酸水溶液等体积的甲醇‑水溶液，经200‑300r/m转速搅拌后用筛绢过滤收集滤液，滤渣重复上述操作3‑5次，将滤液合并后以板框压滤机压滤得到橙黄色毒液；2）橙黄色毒液浓缩脱脂后，在低温条件下以活性炭脱色纯化，滤出活性炭，再加入大孔吸附剂同时以90‑120r/m转速搅拌进一步吸附纯化，反应30‑35min，布氏漏斗抽滤得到浅黄色毒液；3）将浅黄色毒液通过阳离子交换树脂柱，至树脂吸附至饱和状态后以去离子水洗阳离子交换树脂柱，再以醋酸‑醇‑水体系溶液洗脱，收集洗脱液；4）对洗脱液进行冷冻干燥和减压浓缩，至洗脱液体积减少至原体积的1/3‑1/4得到浓缩河豚毒素毒液，以纳滤膜对浓缩河豚毒素毒液进行纳滤收集滤液，再对滤液重复进行三次纳滤处理，得到无杂质河豚毒素毒液；5）将无杂质河豚毒素毒液通过交联葡聚糖凝胶柱，以去离子水洗交联葡聚糖凝胶柱，再用pH值为3‑4的醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液得到液态河豚毒素粗品；6）向液态河豚毒素粗品中滴加氨水调节pH至9‑10，优选调节pH至9.2‑9.5，在低温减压环境下静置20‑24h，得到河豚毒素粗品；7）将河豚毒素粗品溶于以醋酸‑醇体系溶液溶解，再滴加氨水调节pH至9‑10，优选调节pH至9.2‑9.5，在低温减压环境下静置20‑24h，得到所需河豚毒素。...

【技术特征摘要】
1.一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）将河豚内脏捣碎、匀浆，倒入pH值为3.5-4.5的醋酸水溶液加热煮沸，冷却后加入与醋酸水溶液等体积的甲醇-水溶液，经200-300r/m转速搅拌后用筛绢过滤收集滤液，滤渣重复上述操作3-5次，将滤液合并后以板框压滤机压滤得到橙黄色毒液；2）橙黄色毒液浓缩脱脂后，在低温条件下以活性炭脱色纯化，滤出活性炭，再加入大孔吸附剂同时以90-120r/m转速搅拌进一步吸附纯化，反应30-35min，布氏漏斗抽滤得到浅黄色毒液；3）将浅黄色毒液通过阳离子交换树脂柱，至树脂吸附至饱和状态后以去离子水洗阳离子交换树脂柱，再以醋酸-醇-水体系溶液洗脱，收集洗脱液；4）对洗脱液进行冷冻干燥和减压浓缩，至洗脱液体积减少至原体积的1/3-1/4得到浓缩河豚毒素毒液，以纳滤膜对浓缩河豚毒素毒液进行纳滤收集滤液，再对滤液重复进行三次纳滤处理，得到无杂质河豚毒素毒液；5）将无杂质河豚毒素毒液通过交联葡聚糖凝胶柱，以去离子水洗交联葡聚糖凝胶柱，再用pH值为3-4的醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液得到液态河豚毒素粗品；6）向液态河豚毒素粗品中滴加氨水调节pH至9-10，优选调节pH至9.2-9.5，在低温减压环境下静置20-24h，得到河豚毒素粗品；7）将河豚毒素粗品溶于以醋酸-醇体系溶液溶解，再滴加氨水调节pH至9-10，优选调节pH至9.2-9.5，在低温减压环境下静置20-24h，得到所需河豚毒素。2.根据权利要求1所述的一种制备高纯河豚毒素的方法，其特征在于，步骤1）中甲醇-水溶液中甲醇含量为8-10%，筛绢孔径为350目...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾军杰，张小军，陈思，卢义博，李奇富，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，江苏美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33