检测从体液或组织提取的合成寡核苷酸的方法技术

一种检测存在于体液或组织中的合成寡核苷酸的方法，该方法包括下列步骤： （ａ）用蛋白酶消化体液或组织样品； （ｂ）用分配剂抽提该蛋白酶消化的样品； （ｃ）用异丁醇和乙醚抽提存在于样品中的核酸，包括待检测的合成寡核苷酸； （ｄ）将核酸重新悬浮至溶液中； （ｅ）将核酸连接至杂交膜上； （ｆ）用与待检测的合成寡核苷酸互补的标记寡核苷酸探针处理具有连接核酸的膜； （ｇ）洗涤膜以除去任何不与连接在膜上的核酸杂交的标记寡核苷酸；和 （ｈ）检测膜上探针。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测特定核酸序列的方法。更具体地说，本专利技术涉及检测存在于体液或组织内的合成寡核苷酸的方法。对存在于细胞内的特定核酸序列的检测方法在现有技术中通常是已知的。Southern(J.Mol.Biol.98503-517，1975)提出了在由凝胶电泳分离的DNA片断中检测特定序列的方法，该方法使用“印迹”方法将DNA片断转移至薄膜，然后用放射性探针与变性的DNA片断杂交并放射自显影。这一方法也已经用于检测从细胞或组织中提取出的RNA分子，近些年来，已经开发了更快且定量的“点印迹”方法用于快速检测从组织或细胞中获得的DNA或RNA。最近，人们对开发合成寡核苷酸在所谓的反义方法中作为治疗剂或基因表达调节剂方面已产生相当大的兴趣。例如，Agrawal(Trends in Biotechnology 10152-158，1991)广泛地阐述了反义治疗方法的发展。为了使反义治疗方法有效，必须将寡核苷酸引入患者体内并达到所需治疗的特定组织处。因此，需要在体液或组织中检测寡核苷酸的存在。在动物模型中，已经将放射性标记的寡核苷酸施用给动物，它们在动物体液和组织中的分布也已经由提取这些寡核苷酸然后用放射性自显影术检测到。(参见Agrawal，Tems-amani和Tang，Proc.Natl.Acad.Sci.887595-7599，1991)。然而，作为一种实用的方式，这些方法都不能延用于人类患者。不幸的是，用于检测存在于体液或组织内的特定未标记核酸序列的各种技术仅适用于多核苷酸，例如大的DNA或RNA分子。由于寡核苷酸分子较小，存在与非特异性结合或背景以及无结合相关的、检测不到或假阴性的特殊问题。因此，仍需要开发一种用于检测存在于体液和组织中的特定合成寡核苷酸序列的方法。本专利技术提供了一种检测从实验动物或人类患者获得的体液或组织样品中合成寡核苷酸存在的方法。在本专利技术的方法中，体液或组织样品是从已经施用了寡核苷酸的动物或人类中获取的，经蛋白酶消化后进行提取，然后将全部核酸转移至杂交膜。将该附着有核酸的杂交膜进行预杂交，然后与被标记的寡核苷酸杂交。该被标记的寡核苷酸与给动物或患者施用的寡核苷酸是互补的。然后用标准的方法检测杂交上的被标记的寡核苷酸。本专利技术的方法用于在经历反义寡核苷酸治疗的患者和用于研究寡核苷酸药物动力学性质的动物模型中检测和定位寡核苷酸。附图的简单要说明附图说明图1是根据本专利技术方法，使用如实施例1-5中详细描述的放射性标记探针的一个方案的图解表示。图2表示从描述于实施例1-5的使用放射性标记探针的实验中获得的放射自显影结果。在A组(即对照组)中，将50、25、12.5、6.2、3.1、0ng寡核苷酸(从上到下)直接涂于杂交膜上。B组表示将相同量的寡核苷酸加至血清中，然后如实施例1-5中所述的方法处理。图3是根据本专利技术的方法，使用如实施例1-5中详细描述的抗原标记探针的一个方案的图解表示。图4表示从描述于实施例1-5的、使用放射性标记探针的实验中获得的放射自显影结果。上图表示放射自显影。下图表示放射自显影的扫描光密度测定对已知浓度的寡核苷酸的曲线图。图5说明使用同位素或非同位素检测的本专利技术方法的应用。本专利技术涉及检测存在于体液或组织中的特定核酸序列的方法。具体地说，本专利技术涉及在施用过这类寡核苷酸的动物或人类患者的体液或组织中检测合成寡核苷酸的方法。本专利技术提供了一种检测从体液或组织中提取的合成寡核苷酸的方法。这里所使用的“寡核苷酸”包括(但不限于)所有5＇至3＇连接的、2＇一修饰的核苷和/或脱氧核糖核苷聚合物，其中的连接可以是天然的磷酯连接或诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯或磷酸三酯的人造连接。另外，这样的寡核苷酸还包括在碱基和/或糖残基上有修饰的寡核苷酸以及那些在3＇端和/或5＇端具有核酸酶抗性的大取代基的寡核苷酸。这里所用的“体液”包括(但不限于)血液、尿液、汗液、粘性分泌物、脑脊髓液和滑液。当使用血液时，最好离心分离出细胞以获得血清或血浆，并从血清或血浆中提取核酸。“组织”包括构成任一器官的那些物质，例如淋巴组织、肝、肾、肺、脑、肠、平滑肌、心肌、横纹肌、真皮和表皮等等。在本专利技术的方法中，按下列方式处理体液样品或组织样品。首先，用合适的蛋白酶，例如蛋白酶K、链霉蛋白酶或另一种常规蛋白酶，将体液进行蛋白酶消化。然后，用分配剂，优选用苯酚/氯仿/异戊醇抽提该样品。然后，用异丁醇和乙醚提取核酸。下一步，将核酸重新悬浮于溶液中，使其单链化并将其涂覆且结合于合适的杂交膜上。这样的膜包括(但不限于)尼龙和Pall A膜。下一步，用标记的寡核苷酸处理该结合有核酸的膜，该标记的寡核苷酸与待检测的寡核苷酸是互补的。用该互补的寡核苷酸杂交，然后将未杂交的寡核苷酸洗掉。适宜的标记包括放射性同位素标记，如32P或35S，和任何其它常规标记，如荧光标记(如若丹明或荧光素)、化学发光标记或生物素和酶。这样的标记可直接结合在寡核苷酸探针上。可以选择的是，在优选方案中将抗原连接在寡核苷酸上，通过将标记与特异地与抗原结合的抗体偶联使标记与探针相连接(该探针与其靶序列杂交)。最优选的方案使用连接有抗原地高辛配基(digoxigenin DIG)的探针和接合有碱性磷酸酯酶的抗DIG抗体或抗原结合抗体片断。在这一方案中，通过加入稳定的磷酸化的化合物来检测探针，这种化合物一经去磷酸化作用就产生可用放射自显影术检测的发光。为了本专利技术的目的，术语“放射自显影”意为通过将底片与经探针杂交的杂交膜并置而使照相底片曝光的曝光方法，不管该光线是日光、X射线，或由放射活性化合物衰变而释放的α或β粒子或γ射线。本领域的技术人员将认识到在本专利技术的方法中任何其它抗原均可用来代替DIG而且在作用上与DIG相当。本领域的技术人员还将认识到其它配体一受体对能取代抗原抗体对并与其功能相当。最后，本领域的技术人员还将认识到任何其它产生化学发光的酶一底物的组合都可代替碱性磷酸酶和其试剂，而且功能相当。杂交和洗涤的条件是特别重要的，对于具有离子型核苷酸间连结的寡核苷酸，如寡核苷酸磷酸二酯或硫代磷酸酯来说，发现在6×SSC中37℃下杂交3-16小时，然后在6×SSC中室温下洗涤5-10分钟，对于使用具有62％G＋C含量的25个碱基的探针检测具有56％G＋C含量的25个碱基的寡核苷酸来说是适宜的。当使用的条件较重时，检测不到靶寡核苷酸。但当使用的条件较轻时，背景杂交会掩盖真正的信号。对于具有非离子型修饰的核苷酸间连结或较低G＋C含量的寡核苷酸来说，使用较轻的条件(例如较低的温度、较高的盐浓度)可能是有益的。对较长的寡核苷酸或具有较高G＋T含量或RNA组分的寡核苷酸，使用较重的条件(例如较高温度、较低盐浓度和/或存在如甲酰胺的氢键竞争剂)可能是有益的。解链温度和不同经修饰的核苷酸间连接之间的关系已有详细的描述(参见例如美国专利5,149,798号的图9，其内容在此引入作为参考)。对于任何给定的经修饰的寡核苷酸，杂交是用靶寡核苷酸直接涂布的杂交膜，以下面实施例4所述的条件开始的。然后，对于不同修饰的寡核苷酸，减轻或增重所用条件，直至达到可检测3ng靶寡核苷酸的检测极限。只有在这时，背景和检测不到的问题才被解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾马尔·坦萨马尼，休德海尔·阿格里沃尔，
申请(专利权)人：海布里顿公司，
类型：发明
国别省市：