酪氨酸酶衍生的分离肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及对异常细胞表面上存在的人白细胞抗原分子和酪氨酸酶衍生的肽的复合物进行鉴别。本发明专利技术还涉及对上述观察到的异常状态进行治疗和诊断的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及衍生自酪氨酸酶的分离肽及其应用，所说肽是由HLA-A2和HLA-B44分子呈递的。另外，本专利技术涉及鉴别被诊断患有细胞异常状态的个体之能力，其中细胞异常状态的异常细胞呈递这些肽和HLA-A2和HLA-B44的复合物，还涉及呈递的肽及其衍生物。背景和现有技术哺乳动物免疫系统识别外源和外来材料并发生反应的过程是一个复杂的过程，该系统的一个重要的方面是T细胞应答。这种应答要求T细胞识别称作为人白细胞抗原(“HLA”)或者主要组织相容性复合物(“HMCs”)的细胞表面分子和肽形成的复合物并与之发生作用。这些肽来源于被也能呈递HLA/MHC分子的细胞加工的较大分子。参见例如Male et al.，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是第6-10章。由于要求T细胞特异于HLA分子和一种肽的特定结合，所以T细胞和HLA/肽的复合物的相互作用受到限制。如果不存在特定的T细胞，即使存在其配体复合物也没有T细胞应答。同样，如果没有特定的复合物但存在T细胞，也不发生应答。其机理涉及免疫系统的外来材料的应答，自身免疫病理学，和对细胞异常的应答。最近，更多的研究集中于将蛋白质加工为HLA结合肽的原理，在这方面，参见Barinaga，Science 257880(1992)；Fremont el al.，Science 257919(1992)Matsumura et al.，Science 257927(1992)；Latron et al.，Science 257964(1992)。在癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机理，例如PCT申请PCT/US92/04354，1992年5月22申请，1992年11月26日公开，作为本文的参考，其中公开了一个基因族，它被加工为肽，该肽依次在细胞表面表达，从而导致由特异性CTLs裂解肿瘤细胞。据说这些基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，并且将由此产生的肽称作为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。有关该基因族的其它信息参见Traversari etal.，Immunogenetics 35145(1992；vander Bruggen et al.，Science 2541643(1991)。在美国专利申请系列号938,334(作为本文的参考)中，公开了与HLA-A1分子结合的九肽。该参考文献告诉我们，如果已知特定肽与特定HLA分子的特异性，应该可以预期该特定肽与一种HLA分子结合，但不与另一种结合。这是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。因此尽管对作为特定的HLA分子的配体的特定肽的鉴别具有诊断和治疗意义，但他们仅与有特定HLA分子表型的个体相关。在该领域内还需要作进一步的研究，因为细胞异常状态并不局限于一个特定的HLA表型，进行有目的治疗需要一些已经公开的异常细胞表型知识。酪氨酸酶催化将酪氨酸转化为脱羟基苯基丙氨酸或者“DOPA”的反应并且显示选择性的在黑素细胞上表达(Muller el al.，EMBOJ72715(1988))，在Kwon，U.S.Patent NO.4,898,814最早报道有关人的该酶的cDNA。由Bouchardet al.，J.Exp.Med.1692029(1989)的最近报道提供了稍微有差异的序列。对于鉴别该酶的抑制剂已经花费了大量的精力，因为它与色素沉着疾病有关。该文献的一些例子包括Jinbow，wo9116302；Mishima et al.，U.S.Patent NO.5，077,059，和Nazzaropor，U.S.Patent No.4,818,768，技术人员对其它公开类似物质的文献是熟知的。美国专利申请08/081,673(1993年6月23日申请，作为参考文献)公开了可以将酪氨酸以类似于外源抗原或TRAP分子的方式处理，即，发现对于特定的细胞异常状态，例如黑素瘤，在异常细胞中酪氨酸酶被加工并且由此产生的一种肽与HLA分子形成一种复合物。发现这些复合物可被胞溶性T细胞(“CTLs”)识别，裂解此异常细胞。对这种令人惊奇的和出入意料的现象的细节已进行了讨论。目前已经发现另外的肽也可作为由HLA/AR分子呈递的肿瘤排斥抗原。这些内容在申请号NO.08/203,054,1994年2月28日申请的申请中描述，该申请作为本文参考文献。目前已经发现来源于酪氨酸酶的另外的肽是肿瘤排斥抗原，他们是由MHC分子HLA/B44呈递的，并且被胞溶性T细胞溶解。附图简述附图说明图1集合性的描述了细胞溶解研究结果，具体是图1A显示细胞系LB24/MEL的裂解；图1B显示细胞系SK29/MEL的裂解；图1C显示细胞系LB4/MEL的裂解；图1D显示细胞系SK23/MEL的裂解；图1E显示细胞系LE516/MEL的裂解；图1F显示细胞系SK29/MEL.1.22的裂解；该细胞系已经失去了HLA-A2表达能力；图1G显示MZ2-MEL失去溶解能力；图1H显示对NK靶K562进行研究的溶解情况；图1I显示在用编码HLA-A2的基因转染之后，图1F变异体失去溶解能力；图1J显示来自患者SK29的自体EBV转化的B细胞的溶解情况。图2显示对CTL IVSB的TNF释放情况进行的研究。图3描述了CTL 210/9的TNF释放情况的研究。图4描述肽YMNGTMSQV被胞溶性T细胞克隆CTL-IVSB识别但不被胞溶性T细胞克隆CTL2/9识别。图5显示肽YMNGTMSQV不被胞溶性T细胞克隆CTL 210/9识别。图6显示在各种细胞，包括那些在其表面呈递HLA-B44的细胞进行的TNF释放试验的结果。图7集合性的显示利用本申请中描述的肽在三个不同细胞系上进行的一系列铬释放试验。图7A显示使用SEQ ID No4肽进行的试验。图7B显示使用SEQ ID No5肽的结果。图7C显示使用SEQ ID No2肽进行的试验获得的结果。在图7中，利用标记“○”表示细胞系T2，用“□”表示不能呈递HLA-A2的MZ2-MEL，以及用“●”表示已经被转染能呈递HLA-A2的MZ2-MEL。实施例12描述了这些检测试验。图8A和8B显示利用能呈递MHC分子HLA-B44的细胞系和胞溶性T细胞克隆22/31(下文中称为“CTL22/31”)进行的研究。在图8A中，用单克隆抗体W6/32预培养细胞系(“Rosi EBV”)，而图8B中没有进行预培养。优选实施例的详细描述实施例1在下面的试验中使用黑素瘤细胞系SK 29-MEL(在文献中也称作为SK MEL-29)和LB24-MEL，这两种细胞系已经被研究者使用了许多年。从患者SK29(AV)和LB2(这些患者也分别是SK MEL-29和LB24-MEL的来源)获得含有单核血细胞的样品。将黑素瘤细胞系与含有单核血细胞的样品接触。观察该混合物中黑素瘤细胞系的溶解情况，这种溶解作用表明在样品中存在特异于由黑素瘤细胞呈递的肽和HLA分子的复合物的胞溶性T细胞(“CTLs”)。所使用的溶解试验是由Herin et al.，Int.J.Cancer 39390-396(1987)，作为本文参考文献，呈递的铬释放试验。但是下文中描述了该检测法，体外培养靶黑素瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴别一种候选患者的方法，该候选患者适用于用特异于ＭＨＣ分子和酪氨酸酶衍生的肽形成的复合物的治疗剂进给治疗，复合物中的肽选自于下列组：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８，该方法包括： （ｉ）将来自患者的异常细胞样品与特异于所说复合物的胞溶性Ｔ细胞接触，并且 （ｉｉ）确定至少部分所述异常细胞样品发生的溶解，指明该候选患者适用于所述治疗。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯沃尔费尔，阿兰范佩尔，文森特布里查德，蒂尔瑞布恩法勒尔，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]