可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系制造技术

一种适合于在各类基因分析中应用的可常温保存的固态全组分聚合酶链反应体系。由液态全组分聚合酶链反应体系加入混合保护剂后经采用全系统预冷方式冷冻干燥而成。具有保存方便、操作简单快速、实验结果稳定可靠、适合基层及野外使用、减少由于扩增产物污染造成的假阳性等优点，对进一步促进基因分析技术的推广应用具有很大的意义。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种适合于在各类基因分析中应用的可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系。自1987年以来，聚合酶链反应——这一荣获诺贝尔奖的基因分析技术在生物学、医学所属的各领域中迅速应用，已经成为分子生物学技术中最主要的组成部分之一，在临床检验(如肿瘤、各种感染性疾病、遗传性疾病的早期诊断及器官移植配型)、法医鉴定(如谋杀案、强奸案的痕迹鉴定、亲子鉴定)、环境保护、医学生物学研究中发挥着不可替代的作用。但因聚合酶链反应过程中所需的各种活性成分均不太稳定，加上其工作浓度很低，因此该反应所需的所有活性成分在工作浓度下的混合物(称之为全组份聚合酶链反应体系)很容易降解失活，所以目前均采用先以高浓度溶液形式分开冷冻保存各种成分，用前再混合并稀释的办法。这不仅使其技术操作步骤复杂化；而且使得实验结果的批内、批间操作误差大大增加。更为严重的是聚合酶链反应实际上是一个将标本内的特异基因片段数十万倍地扩增、复制的生物化学反应，在聚合酶链反应以后的各个下游操作中均有可能使该扩增、复制后的大量特异基因片段污染实验室环境及有关的仪器和操作工具，而在以后的混合、稀释操作中难免将该污染物带入新配制的反应体系中，由于聚合酶链反应技术的灵敏度极高，这种混入的扩增产物常会被再次扩增，从而造成假阳性结果(国外称之为Carry Over)，这已成为聚合酶链反应技术最大的缺点。国外甚至以报废整个实验室及所有仪器和操作工具的代价来消除这种假阳性。总之，由于目前普遍采用的液态分别冷冻、用前混合稀释的方法造成了该技术的上述种种不足，因此国际上普遍认为聚合酶链反应是一个灵敏度极高，但稳定性欠佳的方法，很难达到一般分析检测手段所需的规范化、标准化及质量控制要求。这在一定程度上限制了该技术的推广应用。因此，本专利技术的目的，就是克服现有聚合酶链反应体系配制方法中存在的上述诸项不足。以进一步推动基因分析技术的推广应用。一般来讲，对于生化药物的保存通常采用两种措施一是在其溶液中加入高浓度的稳定剂——多为抗氧化剂、抗还原剂、酶活性抑制剂等，而这些均是聚合酶链反应的强抑制物。二是将其冷冻干燥脱水保存，但因聚合酶链反应体系的溶液体积极小(仅有几十个微升)，因此在室温操作中常使预冷冻的样品在十几秒内很快液化，而在冷干过程中水分蒸发所带走的热量又不足以使其温度迅速降低到冰晶点以下，从而造成结晶失活；甚至会出现液化干燥现象，并因水分气化形成贯穿整个溶液的气泡，更造成泡沫张力所致的表面失活。因此这些常规方法单独使用均不适合于聚合酶链反应体系。而我们经过多年的研究和探索，研制出一种国内外未见报导及使用的聚合酶链反应体系制备方法，可以解决现有技术的上述不足。该反应体系被称为“可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系”。该反应体系的组成及制备过程是在常规的液态全组份聚合酶链反应体系中加入一种混合保护剂，其成份为浓度为5-50mM的二巯基苏糖醇(DTT)和浓度为0.2-2mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)；并且采用全系统预冷方式，即将冷冻干燥室及样品全部置于-10℃以下的冷冻环境中进行预冷过程，便可很好地实现全组份聚合酶链反应体系的冻干化，其冻干物在一般冷藏条件(4℃)甚至常温下至少保存六个月而不丧失其活性。上述方法的原理如下二巯基苏糖醇(DTT)为一种巯基保护剂和温和的抗氧化剂，既可保护全组份聚合酶链反应体系中的Taq DNA聚合酶肽链上的巯基；也能防止其中的三磷酸脱氧核糖核苷氧化；同时它在低浓度下对聚合酶链反应的影响并不大。牛血清白蛋白(BSA)可以大大增加体系内的蛋白浓度，利用所谓的群体效应降低Taq DNA聚合酶的降解速度。而全系统预冷方式由于省去了室温操作，也就消除了预冷冻样品的液化现象，因而从根本上防止了结晶失活和表面失活。上述方法首次实现了全组份聚合酶链反应体系的固态化及常温保存，使其保存条件简单化，从而降低贮运成本，这大大地有利于国内基层单位及野外环境下的使用；同时更使得该反应体系可在严格控制的规模化生产条件下预先配制、分装、冻干在反应管内，从而使实用者的操作步骤大为减少，只需将待测样品及蒸馏水加入该反应管即可，这将有利于降低实验结果的批内、批间操作误差，并且减少由于扩增产物污染造成假阳性的机会。因此，本技术具有保存方便、操作简单快速、实验结果稳定可靠、适合基层及野外使用、减少由于扩增产物污染造成的假阳性等优点。对进一步促进这一基因分析技术的推广应用具有很大的意义。下面实施例仅用于说明本专利技术，但本专利技术并不限于该实施例。利用“可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系”检测特异基因片段1将待测标本进行前处理后从样品管中取出5微升液体，与20微升蒸馏水合并加入内含“可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系”的反应管内。2将上述混合液置于基因扩增仪中，接通电源，反应2-3小时。3从反应管内取出一定量的液体进行下游分析。如核酸电泳、紫外观测、分子杂交、DNA序列测定等。由于聚合酶链反应技术在临床检验(如肿瘤、各种感染性疾病、遗传性疾病的早期诊断及器官移植配型)、法医鉴定(如谋杀案、强奸案的痕迹鉴定、亲子鉴定)、环境保护、医学生物学研究中等各个领域中的应用越来越广泛，而本专利技术使其操作过程更为简单、快速；实验结果更为可靠、稳定，因此对进一步促进该项新技术的推广应用具有很大的意义。权利要求1，一种可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系，由液态全组份聚合酶链反应体系经冷冻干燥而成，本专利技术的特征在于其中加入了混合保护剂，并且采用全系统预冷方式。2，根据权利要求1所述的可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系，其特征在于其中加入的混合保护剂成份和终浓度为5-50mM的二巯基苏糖醇(DTT)和浓度为0.2-2mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)。3，根据权利要求1所述的可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系，其特征在于所采用的全系统预冷方式是指将冷冻干燥室及样品全部置于-10℃以下的冷冻环境中进行预冷过程。全文摘要一种适合于在各类基因分析中应用的可常温保存的固态全组分聚合酶链反应体系。由液态全组分聚合酶链反应体系加入混合保护剂后经采用全系统预冷方式冷冻干燥而成。具有保存方便、操作简单快速、实验结果稳定可靠、适合基层及野外使用、减少由于扩增产物污染造成的假阳性等优点，对进一步促进基因分析技术的推广应用具有很大的意义。文档编号C12Q1/25GK1165194SQ9610487公开日1997年11月19日 申请日期1996年5月9日 优先权日1996年5月9日专利技术者刘勇, 杨晓林 申请人:北京医科大学人民医院本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可常温保存的固态全组份聚合酶链反应体系，由液态全组份聚合酶链反应体系经冷冻干燥而成，本专利技术的特征在于：其中加入了混合保护剂，并且采用全系统预冷方式。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，杨晓林，
申请(专利权)人：北京医科大学人民医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]