用于确定抗病毒药物敏感性和抗性和筛选抗病毒药物的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了确定抗病毒药物的敏感性的方法，包括：（ａ）将含有来源于病人的区段和指示基因的抗性测试载体导入宿主细胞；（ｂ）培养来自（ａ）的宿主细胞；（ｃ）测量靶宿主细胞中指示基因的表达；和（ｄ）将来自（ｃ）的指示基因的表达与当缺乏抗病毒药物时进行步骤（ａ）－（ｃ）时测量的指示基因的表达进行比较，其中抗病毒药物以测试浓度存在于步骤（ａ）－（ｃ）；步骤（ｂ）－（ｃ）；或步骤（ｃ）。本发明专利技术同时提供了确定病人的抗病毒药物抗性的方法。本发明专利技术也提供了对候选的抗病毒药物化合物的生物学效力进行评估的方法。提供了含有包括来源于病人的区段和指示基因的抗性测试载体的组合物和抗性测试载体转化的宿主细胞。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于鉴定用于治疗病毒感染的有效药物方式的抗病毒药物敏感性和抗性的测试。本专利技术进一步涉及用于进行这些新的抗病毒药物的敏感性和抗性测试的新的载体，宿主细胞和组合物。本专利技术还涉及对候选药物的抑制选定的病毒序列和/或病毒蛋白质的能力进行筛选。更具体地说，本专利技术涉及利用重组DNA技术首先构建含有病人起源的区段和指示基因的抗性测试载体，然后将抗性测试载体导入宿主细胞，并确定在存在抗病毒药物时靶宿主细胞中指示基因产物的表达和抑制。本专利技术也涉及鉴定当与现存的抗病毒药物比较时具有明显的抗性图谱的抗病毒药物的手段和方法。本专利技术也涉及用于鉴定和评估潜在的治疗化合物的生物学效力的方法和组合物。更具体地说，本专利技术涉及用于提供用于治疗各种病毒疾病例如包括HIV/艾滋病和肝炎的最佳治疗方式的药物敏感性和抗性测试。专利技术背景病毒药物抗性在传染病领域中，特别是当与50多年的抗细菌抗生素的经验比较，将抗病毒化物用于病毒疾病化学治疗和化学预防是相当新的发展领域。抗病毒化合物的设计途径并不是平坦的，因为病毒存在许多独特的问题。病毒必须在细胞内复制并且常常利用宿主细胞的酶，大分子，和细胞器用于合成病毒颗粒。所以，安全和有效的抗病毒化合物必须能够以高效率地区别细胞特异性的和病毒特异的功能。另外，由于病毒复制的特性，对病毒分离株对抗病毒化合物的体外敏感性的评估必须在含有活细胞(如，组织培养物)的复合培养系统中进行。由于所用的组织培养细胞的类型和测试的条件不同，从这样的测试系统获得的结果变化很大。尽管存在这些复杂性，九种药物已被同意用于艾滋病治疗，它们是五种逆转录酶抑制剂AZT,ddI,ddC,d4T,3TC，一种非核苷逆转录酶抑制剂，nevirapine,和三种蛋白酶抑制剂saquinavir,ritonavir和indinovir，并且最近已经开发了另外几种抗病毒候选药物如nelfinavir,delaviridine,VX-478和1592。病毒药物抗性是由高速率的病毒复制和突变频率产生的具体问题。首先识别出了对氨硫脲的痘病病毒的(Appleyard和Way(1966)Brit.J.Exptl.Pathol.47,144-51)，对胍的脊髓灰质炎病毒的(Melnick等(1961)科学134,557)，对金刚烷胺的A型流感病毒的(Oxford等(1970)自然226,82-83；Cochran等(1965)Ann.NY Acad Sci 130,423-429)和对碘苷的单纯疱疹病毒的(Jawetz等(1970)Ann.NY Acad Sci 173,282-291)药物抗性突变体。目前已经鉴定了大约75种抗各种抗病毒试剂的HIV药物抗性突变体(Mellors等(1995)Intnl.Antiviral News,supplement和condra,J.H.等(1996)病毒学杂志70,8270-8276)。病毒的小而有效的基因组可使人们对大多数重要的人病毒致病原的分子遗传学、结构和复制循环进行广泛的研究。结果，将它们用于对抗病毒药物的活性和抗性的位点和机制的定性比任何其它类别的药物更为精确(Richman(1994)微生物学趋势2,401-407)。出现抗性突变体可能性与至少四种因素有关1)病毒突变频率；2)有关特异性抗病毒的病毒靶位点的突变能力；3)抗病毒药物的选择压力；和。4)病毒复制的倍数和速度。关于到第一个因素，对于单链RNA病毒来说，其基因组复制缺乏校对读码机制，突变频率约为每复制循环每碱基对3×10-5次(Holland等(1992)当前的微生物免疫论坛176,1-20；Mansky等(1995)病毒学杂志69,5087-94；Coffin(1995)科学267,483-489)。所以单个10kb基因组，如人免疫缺陷病毒(HIV)，将有望平均在每三代病毒基因组中平均含有一个突变。关于第二个因素，在响应特异性抗病毒试剂时，病毒靶位点的内在突变能力可以明显地影响产生抗性突变体的可能性。例如，zidovudine(AZT)比其它可行的胸苷类似物d4T(stavudine)在体外和体内更容易筛选出HIV的逆转录酶中的突变。抗病毒药物的作用的可能的一个不可避免的结果是它对病毒复制给出足够的选择性压力，从而筛选出药物抗性突变体(Herrmann等(1977)AnnNY Acid Sci 284,632-7)。关于第三个因素，随着药物接触的增加，对复制病毒群落的选择性压力提高了，从而促进更快速地出现药物抗性突变体。例如，较高剂量比较低剂量的AZT趋向于能更快速地选出药物抗性病毒(Richman等(1990)艾滋病杂志3,743-6)。只要保持显著水平的病毒复制，这一抗性突变体的选择性压力增加了突变体产生的可能性。第四个因素，病毒群落的复制的倍数和速度，对于出现抗性突变体的可能性有重要的影响。许多病毒感染的特征是高水平的病毒复制和高速度的病毒产生。这一点对于HIV以及乙肝和丙型嗜肝DNA病毒的慢性感染尤其正确。在具有与HIV复制水平的提高相关的CD4淋巴细胞数目减少的HIV感染病人中出现的AZT抗性的可能性提高。较高水平的病毒增加了预先存在突变体的可能性。已经显示抗性群落的出现产生于预先存在的亚群落的存活和选择性增殖，而该亚群落是在缺乏选择性压力的情况下任意出现的。所有病毒有一个基本突变速度。计算在HIV感染过程中每天出现的约1010个新病毒粒子(Ho等人，(1995)自然373,123-126)，每核苷酸10-4到10-5的突变速度保证了在HIV感染过程中在任何时间点差不多预存在任何突变。药物抗性突变体确实存在于HIV感染个体的HIV的亚群落中的证据正在积累(Najera等(1994)艾滋病研究人反录病毒10,1479-88；Najera等(1995)病毒学杂志69,23-31)。同时有文献记载药物抗性细小核糖核酸病毒突变体以约为10-5的比率预存在(Ahmad等(1987)抗病毒研究8,27-39)。人免疫缺陷病毒(HIV)获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)是致命的人类疾病，通常认为是至今影响人类的较严重的疾病之一。就全球来说，人免疫缺陷病毒(HIV)感染个体和艾滋病病例的数目无情地增加，并且一些人确信治疗这种疾病的努力的效果有限。现已认识到有两种类型的HIV:HIV-1和HIV-2。到1994年1月31日，世界卫生组织已经报道了总数为1,025,073例艾滋病病例。这只是总病例的一部分，WHO估计，在1994年后期，包括未诊断的，未报告的，和推迟报告的，并根据HIV感染的估计数目，在世界范围累计已经有超过4.5百万的艾滋病病例(Mertens等(1995)艾滋病9(Suppl A),S259-S272)。由于HIV开始传播于北美，欧洲和亚沙哈拉非洲，估计超过19.5百万男人，妇女和儿童已经被感染(出处同上)。艾滋病流行的一个明显的特征是它在近20年中全球传播，今天大约190个国家有艾滋病病例报道。WHO的世界范围的HIV感染项目才刚刚起步。据推测，到2000年成年人艾滋病病例总数将累计近1千万。到2000年，成年人中HIV相关的累计死亡人数将从目前的约3百万总数上升到超过8百万。HIV-1和HIV-2是含有两个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于确定抗病毒药物的敏感性的方法，包括：（ａ）在宿主细胞中导入含有病人起源的区段和指示基因的抗性测试载体；（ｂ）培养来自（ａ）的宿主细胞；（ｃ）测量靶宿主细胞中指示基因的表达；（ｄ）将来自（ｃ）的指示基因的表达与在缺乏抗 病毒药物时进行步骤（ａ）到（ｃ）时测量的指示基因的表达比较，其中抗病毒药物以测试浓度存在于步骤（ａ）到（ｃ）；步骤（ｂ）到（ｃ）；或步骤（ｃ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔J卡彭，克里斯托约翰彼得罗普洛斯，
申请(专利权)人：病毒科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]