奶牛性别决定区基因核心序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供奶牛性别决定区（ＳＹＲ）基因的１９０ｂｐ核心序列，并使用该序列用作检测奶牛胚胎性别的物质。通过设计合成特异于奶牛ＳＲＹ基因的引物，采用ＰＣＲ技术检测奶牛胚胎性别。该使用方法快速、准确、灵敏，可在生产现场应用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物养殖中的育种，使用奶牛性别决定区基因核心序列作为检测奶牛胚胎性别的物质。选择性别确定的动物胚胎进行移植，在动物育种工作中有重要意义。以奶牛场为例，移植雌性奶牛胚胎，尽可能多地获得母牛，可以大大提高牛奶年产量；同样以育种为目的的种牛场，由于母牛的繁殖能力远远小于公牛，通过控制子代性别，可以提高繁育工作效率。而以肉牛供应为目的的农场，则需要尽可能多地获得公牛。为此，需要某种方法以确定动物胚胎的性别。Welshons等(Welshons WJ.，PNAS，1959，45560-566)首先发现Y染色体是雄鼠的性别决定因素。在其它动物，如人(Jacobs PS.，Nature，1959，183302-303；Ford CE，et al.Lancet，1959，I，711-713)的性别也是由Y染色体决定的。通过对保守区的分析，1966年将性别决定区定位于Y染色体短臂(Jacobs PA.，Nature 1966，210；352-354).1986年Page(Page DC.，Cold spring Harb Symp.quant.Bial，1986，51229-235)分析了46，XX男性的X染色体，通过缺失分析方法，把性别决定因子限定在更小的一个范围内。由于分析技术的发展，以及对一些更特殊的性别畸形病人的分析，1990年，科学家成功地将性别决定因子定位在一个编码80个氨基酸保守基序、不足250bp长的一段DNA序列内，并命名为性别决定区(SRY)，(SinclairAH，et al.Nature 1990，346，279-281，Gubbay J.Nature，1990，346，245-250).Koopman等将含Sry基因的14kb小鼠DNA片段注射到XX的雌性鼠胚内，结果获得了XX性反转的雄性鼠(Koopman P.Nature 1991，351117-121)，确定了Sry基因在性别决定中的作用。通过测序分析表明，人的SRY基因与鼠的Sry基因有80％的同源区。由于SRY基因核心序列不足250bp，因而有可能通过PCR方法检测动物胚胎SRY基因的有无，以确定胚胎的性别。本专利技术的目的是提供奶牛SRY基因核心序列，并使用该序列用作检测奶牛胚胎性别的物质，应用PCR技术检测胚胎。该使用方法灵敏、可靠、快速，可在现场应用。本专利技术提供的奶牛SRY基因的核心序列是采用直接测序技术测定。利用哺乳动物SRY基因进化上十分保守的特点，本专利技术根据已经发表的人、鼠、兔子的SRY基因序列，设计合成了引物1、2(序列见表1)。以奶牛基因组DNA为模板，加入含有引物1、2的PCR扩增体系中进行PCR扩增(详见实施例1)。扩增产物进行凝胶电泳分析。结果雄性奶牛有长度为208bp的扩增带，而雌性奶牛无扩增产物(图2)。证明该PCR引物对对奶牛性别是特异的。以雄性奶牛基因组DNA为模版，以双链DNA循环测序法，应用引物1或引物2对SRY基因进行直接测序，测出奶牛SRY基因的核心序列190bp，其核心序列见图1。根据得到的奶牛SRY基因核心序列，本专利技术设计合成了特异于奶牛SRY基因的引物3、引物4(序列见表1)，用于奶牛胚胎SRY基因的PCR方法检测。引物3和引物4序列的位置见图1。以此引物对奶牛基因组DNA进行扩增，出现127bp扩增条带的样本，即代表为雄性奶牛，由此可以鉴定奶牛胚胎的性别。为了排除PCR假阴性结果，本专利技术在PCR扩增时设置了内对照，即同时扩增所有奶牛体内都存在的β珠蛋白基因片段。本专利技术以引物PCO3、PCO4对奶牛β珠蛋白基因进行PCR扩增，扩增产物长110bp。通过对奶牛胚胎基因组DNA进行PCR扩增和扩增产物分析，就能对奶牛胚胎性别进行鉴定(图3)。本专利技术提供了奶牛性别决定区基因核心序列，并使用该序列作为检测奶牛胚胎性别的物质，应用PCR技术检测胚胎，该使用方法灵敏、快速，可在现场应用；由于设计了内对照，可排除PCR假阴性错误，保证鉴定结果可靠。应用本专利技术共对109枚奶牛胚胎进行了性别鉴定，结果显示出生的牛犊性别与胚胎鉴定结果完全一致。表1引物 序列1 5’-CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA-3’2 5’-GCCTTCCGACGAGGTCGATACT-3’3 5’-TCAGCAAGCAGCTGGGATATG-3’4 5’-CGAGGTCGATACTTATAGCCC-3’PCO3 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’PCO4 5’-GGTGAACGTGGATGAAGTTG-3’下面通过附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述。 附图说明图1是本专利技术提供的奶牛SRY基因的190bp核心序列。图中有下划线的为引物3和引物4序列的位置。图2是本专利技术用引物1和引物2，PCR方法扩增奶牛SRY基因电泳分析图MDNA分子量标准；1，2，3，4，6泳道为雌性母牛，5，7泳道为公牛；208bp为雄性奶牛SRY基因PCR方法扩增特异条带，110bp为内对照基因(奶牛β珠蛋白基因)PCR扩增特异条带。图3是本专利技术应用引物3和引物4，PCR方法扩增奶牛SRY基因，以鉴定胚胎性别的电泳分析图。MDNA分子量标准；1，2，3，4，6泳道为雌性奶牛胚胎；5，7泳道为雄性奶牛胚胎。127bp为雄性奶牛SRY基因PCR扩增特异条带，110bp为内对照基因(奶牛β珠蛋白基因)PCR扩增特异条带。实施例1 PCR方法扩增奶牛SRY基因抽取雄性及雌性奶牛外周血10ml，抽提全血DNA。根据公开发表的人、鼠、兔子的SRY基因序列，选取进化上十分保守的片段序列，合成下列2个引物。引物15’-CATTCATCGTGTGGTCTCGCGA-3’引物25’-GCCTTCCGACGAGGTCGATACT-3’各取雄性及雌性奶牛全血DNA 2.5ng为PCR扩增模版，加入到PCR反应管中，再各加入上述引物1和引物2各1ul，以及Taq酶1U、PCR标准缓冲液1ul和dNTP(2.5mM)2.5ul；同时加入引物PCO3和PCO4以扩增内对照基因(即奶牛β珠蛋白基因)。以蒸馏水将反应总体积补充到25ul，置PCR循环仪中，以下述条件进行PCR扩增90℃变性1分钟，55℃退火2分钟，70℃延伸2分钟。共进行35个循环。反应产物在3％NuSieve琼脂糖凝胶版上电泳，条件为80V，3小时。凝胶经溴化乙锭染色后，在紫外灯下观察，如图2所示雄性奶牛均出现208bp长的特异条带，雌性奶牛均无此条带，但是，所有电泳泳道均出现110bp长的内对照基因扩增条带。实施例2，奶牛SRY基因双链DNA循环测序(参考文献Murray V，Nucleic Acids Res.，1989，17(21)8889)以末端标记法标记测序引物(即上述引物1和引物2)。取标记引物各1pmol，5×激酶缓冲液1ul，(γ-32P)ATP 1ul，T4多聚激酶1U，在37℃温度下反应30分钟，再置55℃，5分钟终止反应，置冰浴中备用。取雄性奶牛模板DNA 50 fmol，标记引物1(或引物2)1 pmol，10×Taq测序缓冲液2.5ul，TaqDNA聚合物2.5u，制成预反应液，混匀离心后将预反应液分装为每管8ul，然后分别加到含有4种d本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛性别决定区（ＳＲＹ）基因核心序列，其特征在于该ＳＲＹ基因的１９０ｂｐ核心序列如下所示： １４８ ＴＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡ １８９ ＡＡＡＡＣＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＡ ２３０ ＡＧＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＧＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＣ ２７１ ＡＣＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧＧＧＣＴ ３１２ ＡＴＡＡＧＴＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＧＡＡＣＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾溢滔，黄淑帧，
申请(专利权)人：上海麦克辛生物医学有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]