检测或定量测定核酸种类的方法和组合物技术

本发明专利技术提供测定靶核酸种类的方法，包括下面的步骤：提供附着基质的探针和多个标记探针的阵列，其中选择各个标记探针使具有与靶核酸第一部分互补的第一核酸序列并且其中至少一个附着基质的探针的核酸序列与靶物核酸序列的第二部分互补，这第二部分邻接第一部分；在合适的条件下将靶核酸应用到阵列，使探针序列与互补序列杂交；将标记探针引入阵列中；附着基质的探针与靶核酸杂交；标记探针与靶核酸杂交；标记探针附着于阵列中邻接杂交的探针；和检测阵列中附着于探针的标记探针。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及核酸分析的方法和仪器，并且，特别地，涉及核酸分析的方法和仪器。背景测定核酸样品中四个核苷酸的速率是分子生物学，医药，和生物技术进一步发展的主要技术障碍。从1978年开始就使用了包括在凝胶中分离核酸分子的核酸测序方法。其它己证实的测定核酸序列的方法是通过杂交测序(SBH)。测定核苷酸序列(即样品中A，G，C和T核苷酸的顺序)的传统方法是，在特异核苷酸处降解核酸片段，或者通过复制链的双脱氧链终止来制备随机终止的、差别标志的混合物。得到的1-500bp范围内的核酸片段然后在凝胶上分离，产生梯带，其中相邻样品长度差别在于一个核苷酸。以阵列为基础的SBH研究在分离，降解，合成或成象核酸分子中不需要单个碱基的拆分。使用k个碱基长度的短的寡核苷酸的失配鉴别杂交，可以就靶核酸确定一系列组成k聚体寡核苷酸。靶核酸的序列可以通过独一无二地与重叠评价(scored)的寡核苷酸来装配。有几种途径能实现通过杂交测序。在称之为SBH版本1的方法中，核酸样品排成阵列，标记探针与样品杂交。带有相同系列核酸样品的影印膜可以用来平行评价几种探针和/或探针可以是多重结合(multiplexing的。核酸样品可以排成阵列并且在尼龙膜或者其它合适的支持体上杂交。每个膜阵列可以重复使用多次。版本1对于大量样品成批处理特别有效。在SBH版本2中，探针在位于相应于它们各自序列的基质上排成阵列，标记的核酸样品片段与这些排成阵列的探针杂交。在这种情况下，可以在与所有排列的探针同时杂交反应测定关于片段的序列信息。关于对其它核酸片段的测序，可以重复使用相同的寡核苷酸阵列。阵列可以通过点斑或者原位合成探针而制备。在版本3 SBH中，使用两套探针。在一个实施方案中，一套可以是已知位置探针阵列形式，另一套，标记的一套，可以贮存在多孔平板中。在这种情况下，靶核酸不需要标记。靶核酸和一种或多种标记探针加入到排列的探针系列中。如果接触的探针和一个标记探针两者在靶核酸上会合杂交，它们共价连接，产生与连接的探针的长度的总和相等的被检测的序列。该方法用于测序长核酸片段，例如没有小片段核酸亚克隆的完整细菌基因组。在本专利技术中，SBH被用来有效鉴定和测序一种或多种核酸样品。该方法在核酸诊断，法医学和基因制图中有诸多应用。其也可以用来鉴定遗传病和其它性状成因突变，评价生物多样性和产生多种类型以核酸序列为基础的数据。专利技术概述本专利技术提供检测靶核酸种类的方法，包括下面的步骤提供附着在基质上的探针和多个标记探针的阵列，其中选择的每个标记探针具有与靶核酸的第一部分互补的第一核酸序列，并且其中至少一个与基质附着的探针的核酸序列与靶物的核酸序列的第二部分互补，该第二部分与第一部分邻接；在探针序列与互补序列杂交的合适的条件下将靶核酸加样于阵列；将标记探针加到阵列中；与基质附着的探针和靶核酸杂交；标记探针与靶核酸杂交；标记探针与阵列中邻接杂交的探针附着；和检测与阵列中的探针附着的标记探针。根据本专利技术的优选的方法附着基质的探针的阵列包括一套通用探针。根据本专利技术又一个优选方面，至少两个附着基质的探针限定靶核酸序列的重叠序列，并且更优选至少两个标记探针限定靶核酸序列的重叠序列。还有，根据本专利技术的另一方面是提供一种方法，其用于对已知序列的靶核酸的检测，包括下面的步骤在杂交条件下，核酸样品与一套附着固体基质的固定化寡核苷酸探针接触，其中固定化探针能特异性与所述靶核酸序列的不同部分杂交；在杂交条件下在溶液中，靶核酸与一套标记的寡核苷酸探针接触，其中标记探针能特异性与同所述固定化探针邻接的靶核酸序列的不同部分杂交；固定化探针与标记探针共价连接，所述标记探针与固定化探针(例如用连接酶)在靶序列上紧邻；去除所有没有连接的标记探针；通过测定所述附着于固定化探针的标记探针的存在来测定靶核酸的存在。本专利技术还提供了测定多套部分或完全测序的基因在细胞种类，组织或组织混合物中表达的方法，包括下面的步骤确定对测序基因特异的固定和标记探针对；将未标记的核酸样品和相应的标记探针与固定探针的一个或多个阵列杂交；相邻的杂交的标记的和固定探针之间形成共价键；去除未连接的探针；和通过测定与阵列中预先特定的位置结合的标记探针来确定测序基因的存在。在本专利技术该方面的优选实施方案中，靶核酸将鉴定感染性因子的存在。此外，本专利技术提供寡核苷酸探针的阵列，其包括尼龙膜；尼龙膜上有多个寡核苷酸探针亚阵，亚阵包括多个分立的点斑，其中每一个点斑由多个相同序列的寡核苷酸探针组成；和位于尼龙膜上亚阵之间多个疏水性隔栅，通过这些多个疏水性隔栅防止相邻亚阵之间交叉污染。进一步，本专利技术提供测序在靶核酸中具有第一末端和第二末端的重复序列的方法，包括下面步骤(a)提供多个不同长度的间隔寡核苷酸，其中间隔寡核苷酸包括重复序列；(b)提供已知与重复序列的第一末端邻接的第一寡核苷酸；(c)提供多个第二寡核苷酸，其中一个与重复序列的第二末端相邻，其中多个第二寡核苷酸是标记的；(d)使第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸，和多个间隔寡核苷酸之一与靶核酸杂交；(e)连接杂交的寡核苷酸；(f)从未连接的寡核苷酸分离上连接的寡核苷酸；和(g)检测连接的寡核苷酸中的标记。进一步，本专利技术提供测序在靶核酸中具有第一末端和第二末端的分支点序列的方法，包括下面步骤(a)提供与分支点序列的第一部分互补的第一寡核苷酸，其中第一寡核苷酸从分支点序列的第一末端伸展至少一个核苷酸；(b)提供多个标记的，并且与分支点序列的第二部分互补的第二寡核苷酸，其中多个第二寡核苷酸从分支点序列的第二末端伸展至少一个核苷酸，并且其中从分支点序列的第二末端伸展的第二寡核苷酸部分包括与多个由分支点序列产生的序列互补的序列；(c)使第一寡核苷酸，和多个第二寡核苷酸中的一个与靶DNA杂交；(d)连接杂交的寡核苷酸；(e)从未连接的寡核苷酸分离连接的寡核苷酸；和(f)检测连接的寡核苷酸中的标记。此外，本专利技术提供通过使用探针证明序列的方法，所述探针预计对于靶核酸是阴性的。然后通过使靶核酸与“阴性”探针杂交来证明这些探针与靶核酸不形成完全的配对来证实靶物序列。此外，本专利技术提供使用与不同的标记相配合使得探针在杂交反应中可以是多重结合而没有损失序列信息的寡核苷酸探针分析核酸的方法(即不同的探针具有不同的标记，使得可以区分不同探针与靶物的杂交)。在优选的实施方案中，标记是放射性同位素，或者荧光分子，或者酶，或者电子团物质(electrophore mass)标记。在更优选的实施方案中，在版本III SBH中使用不同标记的寡核苷酸探针，并且一起连接多个探针(多于两个，其中一个探针是固定化探针)。此外，本专利技术提供当与样品中同源核酸相比靶物以非常少的量存在时检测具有已知序列的靶核酸的存在的方法。在优选的实施方案中，靶核酸是以非常低的频率在样品中存在的等位基因，而样品具有来自很多来源的核酸。在另一个优选的实施方案中，靶核酸具有突变序列，并且以非常低的频率存在于核酸样品中。此外，本专利技术提供通过使用单道凝胶(single pass gel)测序证明靶核酸序列的方法。用于单道凝胶测序的引物是由通过SBH获得的序列衍生的，这些引物在标准桑格测序反应中使用，提供靶核酸的凝胶序列信息。通过单道凝胶测序获得的序列然后与SBH衍生的序列相比本文档来自技高网...

【技术保护点】
证明测序结果的方法，包括下面的步骤：使用ＳＢＨ从核酸获得序列；鉴定一套与核酸序列互补但是不是精确互补的探针；在使以一个碱基失配与完全配对相区别的条件下使探针与核酸杂交；证明该探针不与核酸完全配对。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R德尔马纳克，
申请(专利权)人：希斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]