基因测序仪和方法技术

本发明专利技术描述了基因测序仪，生物致密盘和样品制备的方法学。制备了长度恒定的寡核苷酸，并与所描述的生物致密盘和装置结合用于基因测序和策略。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总地涉及基因测序领域。更具体地说，本专利技术涉及一种基因测序仪、和其一起使用的高密度生物致密(光)盘(bio-compact disk)、及其样品制备方法。高密度生物致密盘以及样品制备方法学通常可用于寡核苷酸测序和DNA测序与检测领域。专利技术概述一方面，本专利技术涉及一种从含有寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的样品制备方法，该方法包括(a)形成一个固体载体，所有可能的n聚体寡核苷酸与该载体表面相连；(b)在使样品寡核苷酸和固体载体上的互补性n聚体寡核苷酸杂交的条件下，使步骤(a)所得固体载体与样品接触；(c)使步骤(b)所得固体载体与水解剂接触；(d)使杂交的寡核苷酸与未结合的寡核苷酸分离；和(e)使杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得样品中的n聚体寡核苷酸；其中n是选自整数4-10,000之间的一个整数，最佳的为6-28。另一方面，本专利技术涉及一种从含有寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括(a)使固体载体与样品的至少一部分接触，该固体载体适合交联样品中的寡核苷酸；(b)使步骤(a)所得固体载体与n聚体寡核苷酸混合物接触，接触时间足以使n聚体寡核苷酸与固体载体上互补的n聚体寡核苷酸杂交；(c)使未杂交的寡核苷酸与杂交的n聚体寡核苷酸分离；(d)使杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得与样品中的寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；其中n是选自整数4-10,000之间的一个整数，最佳的为6-28。另一方面，样品制备方法包括从含寡核苷酸片段的样品中获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括(a)使固体载体与多个具有(k+m)个聚体的寡核苷酸的混合物接触，该固体载体上结合了样品中的寡核苷酸，其中k+m＝n，混合物是多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸的混合物，所述各个第一寡核苷酸均是k聚体，其3′端没有游离的羟基，所述各个第二寡核苷酸均是m聚体，其5′端没有游离的磷酸基团；(b)连接步骤(a)所得固体载体上的寡核苷酸；(c)从固体载体上除去未连接的寡核苷酸；和(d)使残留在固体载体上的杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得与样品中的寡核苷酸互补的n聚体寡核苷酸；其中m，k和n各自是选自6-10,000之间的整数，最佳的为12-40，条件是k+m＝n。在还有一方面，样品制备方法包括从含寡核苷酸片段的样品获得n聚体寡核苷酸的方法，该方法包括(a)使固体载体与多个h聚体寡核苷酸、多个i聚体寡核苷酸和多个j聚体寡核苷酸的混合物接触，该固体载体上连接了多个样品中的寡核苷酸，所述h聚体寡核苷酸各自在3′和5′端有磷酸基团，所述i聚体寡核苷酸各自在3′端有羟基、氨基或巯基且没有末端磷酸基团，所述j聚体寡核苷酸在5′端有羟基、氨基或巯基且没有末端磷酸基团；(b)用化学或酶方法连接步骤(a)所得固体载体上的寡核苷酸；(c)从步骤(b)所得固体载体上除去未连接的寡核苷酸；和(d)使残留在固体载体上的杂交的n聚体寡核苷酸变性，以获得与样品中核苷酸互补的n聚体核苷酸；其中h，i和j各为选自6-10,000的整数，最佳的为18-60，条件是h+i+j＝n。本专利技术还有一方面描述了一种测定元件，该元件包含一个基质，该基质具有一个表面，包括该表面上被改成适合(adapt)连接一个间隔物(spacer)分子的多个分开的区域；多个间隔物分子，各分子的第一末端与各个分开区域中的所述表面连接，所述各间隔物分子被改成以其第二末端与金属表面或标记物连接，所述各个间隔物分子的第一末端和第二末端之间有一个能被断裂的位点；具有第一序列的第一n聚体寡核苷酸，它在间隔物分子的断裂位点和间隔物分子第一末端之间与基本上所有的间隔物分子相连，和具有第二序列的第二n聚体寡核苷酸，它与基本上所有的间隔物分子相连；其中基质表面上基本上没有其它分开的区域含有具有n聚体寡核苷酸、其上连接了第一序列的间隔物分子，且n是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-28。本专利技术还包括一种测定怀疑存在于样品中的基因的(p+q+r)聚体节段序列的方法，该方法包括(a)形成样品与q聚体寡核苷酸混合物的溶液，该混合物含有q聚体寡核苷酸所有可能的序列、或任选地含有所有这些可能序列的亚组；(b)使测定元件与步骤(a)的溶液的至少一部分接触，该测定元件具有一个表面和结合在该表面上的多个间隔物分子，该间隔物分子的第一末端与该表面结合，第二末端与金属表面或标记物结合，在第一和第二末端之间有一个断裂位点，间隔物分子进一步还具有连接在其断裂位点和第一末端之间的第一p聚体寡核苷酸和连接在其断裂位点和第二末端之间的第二r聚体寡核苷酸，p聚体和r聚体的组合包括了 p聚体和r聚体寡核苷酸的所有寡核苷酸序列组合，或任选地包括了所有这些组合的亚组，p聚体和r聚体寡核苷酸的每个特定的序列组合都位于该表面预定位置上；(c)连接上述步骤(b)所得的与间隔物分子连接的所得杂交寡核苷酸；(d)检测该表面上各预定位置处的杂交寡核苷酸的特定序列组合存在与否；和(e)对步骤(d)所得序列信息进行处理，以推导出样品中存在的(p+q+r)聚体寡核苷酸的序列，其中P，q和r是选自4-10,000之间的整数，最佳的为6-26，且(p+q+r)不超过30,000，最佳是60。对一个基因的不同的、多个节段可平行地进行步骤(a)至(e)。附图简述参看了下列附图后会更好地了解本专利技术，其中附图说明图1表示固体载体上多个n聚体寡核苷酸的合成。图2表示用图1的固体载体从含有不同n聚体长度的寡核苷酸混合物的样品中选出n聚体寡核苷酸的方法。图3表示用固体载体通过线性扩增来获得n聚体寡核苷酸的样品。图4表示扩增来获得标记过的寡核苷酸的样品。图5表示用连接酶制备长度恒定的寡核苷酸的方法。图6表示用化学连接或脂肪酶(lipase)制备长度恒定的寡核苷酸的方法。图7表示用于制备表面上连接了寡核苷酸的生物致密盘的两个互补的印模(stamp)。图8表示用图7的印模来印制的一个实例，其中待连接到固体上的固定的(stationary)寡核苷酸位于印模中形成的凹槽(grove)壁上。图9表示用选择性识别-(8，{10}，8-识别)—来测定在染色体上出现两次的16聚体周围的序列。图10表示疏水表面有亲水性腔穴的印模。图11表示图10的印模，其中乳胶球用化学方法结合在腔穴内。图12描述了用来测定一个基因片段有关序列信息的(4，4)聚体识别。图13描述了用来测定一个基因片段有关序列信息的(4，{5}，4)聚体识别。图14A表示一个分级(fractionation)盘。第一次分级可在中央16个区室的区域内进行。级分可在螺旋形通道或毛细管中进一步分级。图14B表示在另一个盘置于图14A所示盘上后，可进行进一步的分级。图14C表示毛细管和一类寡核苷酸区域的交叉情况(intersection)的顶视图。图15表示中央分级区域。样品可围绕该区域循环，在此具体实例中，该区域含有16个区室。每个区室含有一种特异性寡核苷酸亚类探针。图16描述了寡核苷酸可通过变性后转动盘来洗脱到毛细管中。专利技术详述用来实施所附权利要求范围内的本专利技术特定实例的重要的技术背景信息和其它指导可在PCT/US97/11826中找到，该申请目前已经公开，其公开内容立刻被结合入本文作参考。样品制备寡核苷酸阵列在基因测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从含寡核苷酸片段的样品获得ｎ聚体寡核苷酸的方法，该方法包括：（ａ）形成一个固体载体，所有可能的ｎ聚体寡核苷酸与该载体表面相连；（ｂ）在使样品寡核苷酸和固体载体上的互补ｎ聚体寡核苷酸杂交的条件下，使步骤（ａ）所得固体载体与样品接触 ；（ｃ）使步骤（ｂ）所得固体载体与水解剂接触；（ｄ）使杂交的寡核苷酸与未结合的寡核苷酸分离；和（ｅ）使杂交的ｎ聚体寡核苷酸变性，获得样品的ｎ聚体寡核苷酸；其中ｎ是选自整数４－１０，０００之间的一个整数，最佳的为６－２８。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J弗塔嫩，
申请(专利权)人：伯斯坦技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]