用于鉴定选择性抑制丙型肝炎病毒复制的试剂的新筛选方法技术

本发明专利技术涉及检测抗病毒试剂的新方法，此抗病毒试剂选择性干扰病毒蛋白，其中该病毒蛋白可使干扰素诱导的细胞抗病毒感染的防御机制失效。公开了鉴定可选择性抑制含干扰素敏感决定区的病毒蛋白与干扰素诱导的ＰＫＲ蛋白激酶之间的相互作用的试剂的筛选分析。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请要求1997年3月5日提交的美国临时申请流水号60/038,596的权益。1.简介本专利技术涉及鉴定抗病毒试剂的新方法，该试剂可选择性干扰病毒蛋白，该病毒蛋白可使干扰素(IFN)诱导的细胞抗病毒感染的防御机制失效。本专利技术尤其涉及鉴定可选择性抑制含干扰素敏感决定区(ISDR)的病毒蛋白与IFN诱导的PKR蛋白激酶相互作用的试剂的筛选方法。本专利技术更具体而言涉及鉴定可选择性抑制丙型肝炎病毒(HCV)非结构的5A蛋白(NS5A)(含ISDR)与IFN诱导的PKR蛋白激酶的相互作用的试剂。病毒的ISDR与IFN诱导的PKR蛋白激酶间的相互作用导致IFN-诱导的细胞防御机制对抗病毒感染的失效。因此，采用本专利技术的方法鉴定的试剂可用作抗病毒剂。2.背景2.1针对病毒感染治疗的IFN(干扰素)疗法干扰素为胞外信号蛋白，具多种不同作用，包括免疫刺激，肿瘤抑制，和细胞增殖减少。干扰素诱导宿主细胞中多种基因产物的生产，包括Mx蛋白，2′-5′寡腺苷酸合成酶和RNA酶L.(综述见Sen等，1992，生物化学杂志，2675017-5020；Sen等，1993，病毒研究进展4257)。另外，PKR，非cAMP依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，为一种大于30的IFN诱导的基因产物(Meurs等，1990，细胞62379-590)。这些蛋白表现出具抗病毒感染的保护作用，因此对IFN治疗病毒感染的有益作用有贡献。IFN诱导的基因产物提供抗病毒感染的保护作用机制很多。例如，IFN诱导双链RNA依赖酶，2′-5′寡腺苷酸合成酶活化可裂解细胞和病毒RNA的RNA酶，从而钝化病毒复制，如细小核酸核酸病毒复制(Kumar等，1988，病毒杂志，623175-3181)。IFN诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶抑制病毒和宿主细胞蛋白合成，通过磷酸化和钝化翻译起始因子eIF-2α的一个亚基。IFN也可在病毒生活周期的不同阶段起抑制病毒作用。IFN抑制乙型肝炎病毒颗粒的脱壳，从而抑制病毒复制。IFN抑制疱疹性口腔炎病毒侵入细胞(Whitaker-Dowling等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.美国国家科学院院刊801083-1086)。IFN还抑制由病毒，如仙台病毒引起的细胞融合(Tomita等，1981，普通病毒学杂志。55289-295)。为抵抗IFN诱导的细胞抵抗机制的有害作用，许多真核病毒发展了阻断IFN诱导的蛋白活性的机制。一些蛋白产生RNA，使IFN诱导宿主细胞翻译关闭无效，例如，腺病毒产生的VAI RNA分子，人免疫缺陷病毒(HIV)TAR区，埃-巴二氏病毒产生的ERER-1RNA分子(Katz等，1987，胚胎杂志，6689-697；McMillan等，1995，病毒学213413-424；Carroll等，1993；Beattie等，1995，病毒学210254-263；Beattie等，1991，病毒学183419-422)。一些病毒如牛痘病毒K3L蛋白，结合并抑制IFN诱导的PKR蛋白激酶(Gale Jr.等，1996，分子细胞生物学164172-4181)。流感病毒，募集细胞因子，如P58结合并阻断PKR蛋白激酶(Lee等，1990，美国国家科学院院刊，876208-6212；Lee等，1994，分子细胞生物学，142331-2342)。2.2丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界性的重要临床问题。仅在美国，就有约4百万人慢性感染HCV。HCV，非甲，非乙肝炎的主要病原体，主要通过血液和血液制品传染(Cathbert等，1994，临床微生物评论杂志，7505-532；Mansell等，1995，肝病论坛(Semin.Liver.Dis.)1515-32)。在1990年代中期进行抗HCV筛选之前，HCV占美国输血后肝炎的80-90％。普通应用注射药物是HCV感染的最常见危险因素，占HCV血清反应阳性人群的80％。HCV感染的高几率也可从出血紊乱和慢性肾衰竭的人看出，这些群体常接触血液及血液制品。HCV的急性感染在约90％病例中导致持久性病毒复制和慢性肝炎进展。对很多病人而言，慢性HCV感染导致进行性的肝损伤和肝硬化的发展。在侵占性感染病人中，肝硬化能在两年中发展起来，尽管更典型的为10-20年时间跨度。30-50％的慢性HCV患者，肝损伤会进一步发展为肝细胞癌。总地说来，肝细胞癌为较晚表现形式，尚需超过30年时间的发展(Bisceglie等，1995，肝病论坛。1564-69)。决定病情进展的病毒或宿主的相关因子不详。HCV为有包膜病毒，包括正义单链RNA基因组约9.5kb。根据基因组组成和病毒粒特性，HCV被划为黄病毒科中独立的属，黄病毒科为包括瘟病毒属和黄病毒属的科(Alter，1995，肝病论坛155-14)。病毒基因组包括长5′非翻译区(UTR)，长开放阅读框编码约3011个氨基酸的多聚蛋白前体，和短3′UTR。5′UTR为HCV基因组中高度保守的区域，对起始和控制多聚蛋白的翻译十分重要。HCV基因组翻译起始为帽非依赖性机制，即内部核糖体进入。该机制包括核糖体与被称为内部核糖体进入位点(IRES)的一段RNA序列结合。RNA假结结构近来被认为是HCV IRES的关键结构元件。尽管HCV复制的可靠组织培养系统尚需进一步发展，但病毒蛋白已被多种技术鉴定，包括运用重组牛痘病毒结构和转录/翻译系统。多聚蛋白前体被宿主和病毒的蛋白水解酶裂解产生成熟病毒结构和非结构蛋白。病毒结构蛋白包括核壳核心蛋白(C)和两个包被糖蛋白，E1和E2。HCV还编码2个蛋白酶，一个是由NS2-NS3区编码的锌依赖的金属蛋白酶，和由NS3区编码的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶要求多聚蛋白前体的特殊区域断裂以产生成熟蛋白。非结构蛋白5的羧基部分，NS5B包括RNA依赖的RNA聚合酶。其它非结构蛋白NS4A和NS4B以及NS5A(非结构蛋白5的氨基端部分)的功能不详。对HCV复制和病理的了解因缺乏细胞培养系统而被严重阻碍。因此有效的对抗HCV感染的抗病毒策略仍需进一步发展。目前唯一用于慢性HCV感染治疗的方法是α-干扰素处理。但少于50％的患者在接受治疗后根除HCV症状减弱(Hoofnagle等，1994；Lino等，1994，病毒相互关系学3787-100)。如上所述，HCV基因型和对干扰素治疗的反应间存在联系(Enomoto等，1996，新英格兰医学杂志33477-81；Enomoto等，1995，临床探索杂志，96224-230)。例如感染HCV-1b的患者的反应率小于40％。感染原型美国基因型HCV-1a的患者反应率亦低(Hoofnagle等，Lino等，1994，病毒相互关系学3787-100)。而感染HCV基因型2的患者反应率高达80％(Fried等，1995，肝病研讨会1582-91)。基因型1b的NS5A蛋白不连续区的氨基酸序列与对干扰素的敏感性有关(Enomoto等，1996，Enomoto等，1995)。该区称为干扰素敏感决定区(ISDR)，从NS5A的氨基酸残基237至276，多聚蛋白的氨基酸2209至2248；根据HCV-J编号，HCV-1b株的全部基因序列决定于此(Enomoto等，1995)。干扰素抗性株(例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选潜在的新型抗病毒剂的方法，这种抗病毒剂能够有效抑制包含干扰素敏感决定部位（ＩＳＤＲ）的病毒蛋白的活性，该方法包括：培养含ＰＫＲ蛋白激酶、病毒蛋白和待测试剂的混合物；以及测量ＰＫＲ蛋白酶活性；与缺乏待测试剂时ＰＫＲ蛋白酶活性相比较 。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MG卡策，小MJ加莱，
申请(专利权)人：华盛顿州大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]