一种新的人辅酶Ⅰ亚基异构体蛋白及其编码序列制造技术

本发明专利技术提供了一种在人体正常肾上腺中表达的新的人ｈＮＤ１ａ－ｉｓｏ蛋白及其编码序列，本发明专利技术还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法，以及在样品中检测人ｈＮＤ１ａ－ｉｓｏ核酸序列和多肽的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本专利技术涉及一种在人类肾上腺中表达的hND1a-iso蛋白及其核酸序列。本专利技术还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase，NDs)由1、2、3、4、5等亚基组成，它们广泛参与了线粒体中各式各样的氧化还原反应。(Curr Genet 1999 Feb；35(1)30-5)。近来的研究表明，ND1的突变还与糖尿病有关。(Biochem Biophys Res Commun1996 Feb 27；219(3)951-5)。本专利技术中，我们在人类肾上腺中克隆到人NADH脱氢酶1号亚基a区(hND1a)的同源基因hND1a-iso。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的人类hND1a-iso蛋白序列及其核酸序列。本专利技术的第一目的就是提供一种新的人基因hND1a-iso(Genbank AccessionNo.AF164796)，该基因是一个人hND1a-iso蛋白基因。本专利技术的第二目的是提供一种新的人蛋白hND1a-iso。本专利技术的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人hND1a-iso蛋白和核酸序列的方法。本专利技术还提供了这种人hND1a-iso蛋白多肽和编码序列的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有人hND1a-iso蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第10-273位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第10-273位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第10-273位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离出的人hND1a-iso蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。在本专利技术的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在一个实例中该宿主细胞是大肠杆菌；在另一实例中，该宿主细胞是真核细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种产生具有人hND1a-iso蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有人hND1a-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hND1a-iso蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第10-273位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hND1a-iso蛋白的重组细胞；(3)在适合表达人hND1a-iso蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有人hND1a-iso蛋白活性的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第10-273位的序列。本专利技术还提供了与hND1a-iso蛋白多肽特异性结合的抗体。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“人hND1a-iso蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hND1a-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第10-273位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的编码框第10-273位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.6中第10-273位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第10-273位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.6中从核苷酸第10-273位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的人hND1a-iso相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本专利技术中，术语“人hND1a-iso蛋白或多肽”指具有人hND1a-iso蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。该术语还包括具有与天然人hND1a-iso相同功能的、SEQ ID NO.7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人hND1a-iso蛋白的活性片段和活性衍生物。本专利技术的人hND1a-iso多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人hND1a-iso DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hND1a-iso多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本专利技术还提供了其他多肽，如包含人hND1a-iso多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本专利技术还包括人hND1a-iso多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hND1a-iso多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。在本专利技术中，“人hND1a-iso保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1 专利技术还包括人hND1a-iso蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hND1a-isc多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有人ｈＮＤｌａ－ｉｓｏ蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６中从核苷酸第１０－２７３位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６中从核苷酸第１０－２７３位的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李能干，钱斌治，张新，高馨，陈竺，韩泽广，
申请(专利权)人：国家人类基因组南方研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]