DNA扩增方法及其试剂盒技术

一种ＤＮＡ扩增方法，它是以含有核苷酸类似物的ＤＮＡ片段为模板，在核苷酸类似物的存在下扩增ＤＮＡ的方法，其特征在于，它在２种以上核苷酸类似物的存在下或降低双链核酸Ｔ↓［ｍ］值的化合物的存在下进行。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及DNA扩增方法，尤其是在DNA混合存在的情况下能选择性扩增RNA相对应的碱基序列的RT-PCR法，以及用于该DNA扩增方法的试剂盒。
技术介绍
DNA扩增方法，尤其是聚合酶链式反应(PCR)是一种在试验管内扩增所要核酸片段的简便技术，现在不仅在基因相关的研究中而且在生物学、医学、农业等广泛领域内是不可缺少的实验方法。PCR原本是扩增DNA的技术，但开发了一种PCR方法，它能扩增具有与相应RNA相对应的碱基序列的DNA片段，将之称为RT-PCR法。该方法是DNA聚合酶的一种，它是用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性、即具有逆转录活性的逆转录酶、或应用同时具有逆转录活性的DNA聚合酶合成与RNA相互补的DNA转录产物(cDNA)，然后以此为模板进行PCR，由此该方法是特异性扩增来源于RNA的cDNA的方法。RT-PCR法除用于制备由mRNA而来的cDNA克隆和cDNA文库外，还可用作检测特定的mRNA表达状态的方法。但是当RT-PCR中所使用的RNA样品中混有DNA的时候，同时扩增出以编码RNA的DNA上区域和该基因作为PCR模板的产物，因此选择性地获取仅以RNA作模板的扩增产物是困难的。因此，为了防止生成由混合在RNA样品中的DNA而来的扩增产物，就有必要应用纯化的RNA样品，或应用通过DNA分解酶处理等除去掺杂的DNA的样品，操作很麻烦。作为解决该问题的方法，有这样一设想通过核苷酸类似物dITP存在下的逆转录反应合成Tm值，即融解温度低的RNA-cDNA双链核酸，再在相同核苷酸的存在下、在低温度性温度下进行RCR反应，由此该方法可抑制因样品中琨杂的DNA所引起的产物扩增，并能选择性扩增由与RNA互补的cDNA而来的DNA片段I核酸研究(Nucl.Acids.Res)第24卷，第5021～5025页(1996)。但是该方法有必要根据扩增的碱基序列的GC含量而改变dITP的添加量和反应温度，很难找到最佳条件。另外，反应性也不尽如意，有时不能以目的碱基序列为基础进行选择性扩增。专利技术的公开本专利技术的目的是提供一种DNA扩增方法，它能克服以往技术方法的缺点，能在混杂有DNA的情况下只选择性获得具有与RNA相对应的碱基序列的DNA片段，且该方法具有广泛应用性，重复性、检测敏感等优点。本专利技术人简明使用上述核苷酸类似物的方法的问题点之一是通常的双链DNA不变性，且由整合了核苷酸类似物的cDNA和模板RNA构成的RNA-cDNA双链核酸变性温度条件的设定是一难点。他们发现该问题可这样解决DNA扩增反应时加入降低RNA-cDNA双链核酸Tm值的化合物，例如甲酰胺等。另外，本专利技术者们考虑到上述方法的另一个问题点是核苷酸类似物向上述方法中合成的DNA链的整合受目的RNA碱基序列，尤其是GC含量的影响本专利技术者们发现向反应液中加入以一定的频率结合到DNA的2种以上的核苷酸类似物，可不受目的RNA GC含量的限制进行DNA扩增，其重复性很好由此完成了本专利技术。也就是说，本专利技术主要涉及(1)以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下进行DNA扩增的方法，其特征在于，它在存在2种以上的核苷酸类似物的情况下或在降低双链核酸Tm值的化合物的存在下进行；(2)以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下扩增DNA的方法中，其特征在于，它在1种或2种以上的核苷酸类似物和降低双链核酸Tm值的化合物的存在下进行；(3)用于以含有核苷酸类似物的DNA为模板，在核苷酸类似物的存在下进行DNA扩增的试剂盒，其特征在于，它含有2种以上的核苷酸类似物或降低双链核酸Tm值的化合物；以及(4)用于以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下扩增DNA的试剂盒，其特征在于它含有1种或2种以上的核苷酸类似物和降低双链核酸Tm值的化合物。实施本专利技术的最佳方式本专利技术的DNA扩增方法是以含有核苷酸类似物的DNA片段作模板，在核苷酸类似物的存在下扩增DNA的方法，其最大的特征之一是它在存在2种以上的核苷酸类似物和/或存在降低双链核酸Tm值的化合物的条件下进行。本专利技术方法中，作为扩增反应模板的DNA片段应用在1种或2种以上核苷酸类似物的存在下，以RNA为模板，通过逆转录反应而制备的cDNA。逆转录反应优选在存在降低双链核酸Tm值的化合物的条件下进行。对包括用于本专利技术方法中的RNA的样品没有特殊限定，例如可应用来源于细胞、组织、血液等生物体的样品，食品、土壤、排水等有可能含有生物的样品。另外，也可以是通过用众所周知的方法处理前面的样品而得到的含有核酸的制备物。这些制备物，例如细胞破碎物和分离它们而得到的样品，该样品中的总RNA、或特定的RNA分子群，如富含mRNA的样品可用于本专利技术。并且，即便这些样品中含有DNA，也不受共存DNA的影响，它能选择性扩增与RNA相对应的DNA。另外，也可应用用众知的方法除去了DNA的样品。用本专利技术的方法所扩增的RNA没有特别限制，可应用样品中的总RNA，mRNA、tRNA、rRNA等RNA分子，可应用能制备逆转录和扩增反应中所用引物的任意RNA。例如，假若以该目的RNA的有无和其含量的增减作为特定疾病的指标，那么应用本专利技术的方法可进行该疾病的诊断。另外，以微生物特异的RNA为目标，可检测样品中该微生物的存在。作为上述扩增对象的RNA，它在1次逆转录反应中的用量只要足以进行逆转录反应即可。例如，从灵敏的角度出发，优选0.1μg以上，更优选0.5μg以上，从反应抑制的角度出发，优选2μg以下，更优选1μg以下。本专利技术中由目的RNA合成cDNA所使用的引物是具有与目的RNA互补碱基序列的寡核苷酸，只要是在所应用的反应条件下能与目的RNA退火即可。该引物也可以是寡(dT)等寡核苷酸和具有随机序列的寡核苷酸(随机引物)等。从进行特异性退火的观点出发，上述引物的长度优选6个核苷酸以上，更优选10个核苷酸以上；从寡核苷酸合成的观点出发，优选100个核苷酸以下，更优选30个核苷酸以下。上述寡核苷酸可这样合成，例如，用ABI公司(Applied Biosystems Inc.)的394型DNA合成仅通过磷酰亚胺法进行合成。除此之外，也可用三磷酸盐法、H-膦酸脂法、硫代亚磷酸盐法等任一方法进行合成。另外也呆以是由生物样品而来的寡核苷酸，例如，从由该样品制备的DNA的限制性核酸内切酶消化物进行分离而制备的。上述引物在逆转录反应液中的使用量只要足以从目的RNA进行。cDNA合成即可，从合成效率的观点出发，优选0.1μM以上，更优选0.5μM以上，从抑制反应的观点出发，优选10μM以下，更优选5μM以下。另外，在DNA扩增反应(PCR)中所使用的引物，只要是能以与目的RNA相对应的cDNA为模板进行DNA扩增则无特殊限定，可使用与上面相同的各种寡核苷酸。由上述目的RNA合成cDNA时使用的引物也可用于DNA的扩增反应。上述引物在PCR反应液中的使用量只要足以用以目的RNA为模板而得到的cDNA为模板进行DNA合成即可，从合成效率的观点来看，优选0.05μM以上，更优选0.1μM以上，从反应特异性的观点来看，优选2μM以下，更优选1μM以下。本专利技术中所应用的具有逆转录活性的酶没有特殊限定，只要是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：山本纯子，向井博之，日野文嗣，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝酒造株式会社，
类型：发明
国别省市：