静息蛋白及其使用方法技术

本发明专利技术描述了一种新型抗－血管生成蛋白质，即静息蛋白（ｒｅｓｔｉｎ），以及其片段。还描述了高效价表达蛋白质的方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请要求1997年12月8日提交的60/082,663申请、1998年4月22日提交的60/083,663申请、和1998年11月16日提交的60/108,536申请的优先权，其全部内容通过在此引述而合并于本篇。本专利技术的背景转移性癌症的预后症状保持着较大可能的不利情况。尽管有放疗和化疗的改进，但过去几十年接受治疗的患者的长期存活率仅表现出很微小的改进。缺少适用于转移性癌症的显著治疗方法强调了应集中发展新型治疗方法。在这一方面，针对固体肿瘤的肿瘤脉管系统治疗在几种动物模型系统中显示出很有希望的结果(Baillie等人(1995)Br.J.癌症72257-67；Bicknell，R.(1994)Ann.Oncol.5(增刊)445-50；Fan等人(1995)趋势Pharmacol.科学1657-66；Thorpe，P.E.及Burrows，F.J.(1995)乳腺癌研究。治疗34237-51；Burrows，F.j.和Thorpe，P.E.(1994)Pharmacol.Ther.64155-74)。如在裸鼠模型中，将野生VHL基因引入到786-0细胞，即一种RCC肿瘤细胞系中，抑制了肿瘤生长(Iliopoulos等人.(1995)Nat.Med.1822-26)和血管生成。超过若干立方毫米(mm3)的固体肿瘤的生长取决于新血管的形成(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.2851182-86)。大量的研究已显示原发性肿瘤和转移性生长都与血管生成有关(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.2851182-86；Folkman，J.(1972)Ann.Surg.175409-16；Folkman，J.和Shing，Y(1992)J.生物化学。26710931-34；Folkman，J(1996)科学.Am.275150-54)。一些血管生成抑制剂已经确定。某些种类，如血小板因子-4(Maione等人(1990)科学24777-79；Gupta等人(1995)Pro，Natl.Acad.科学(USA)927799-7803)，干扰素α，干扰素-可诱导蛋白质-10，和PEX(Angiolillo等人(1995)J.Exp.Med.182155-62；Strieter等人(1995)生物化学，生物物理，研究，交流.21051-57；Brooks等人(1998)细胞92391-400)，是“与肿瘤无关的”，而其他两种，血管生成抑制素(angiostatin)和内抑制素(endostatin)是“与肿瘤有关的”(O’Reilly等人(1994)细胞79315-28；O’Reilly等人(1997)细胞88277-85)。血管生成抑制素，一种由调节基质金属弹性蛋白酶的肿瘤-渗透巨噬细胞产生的有效的血管生成内生抑制剂，抑制很多种原发及转移性肿瘤的生长(Lannutti等人(1997)癌症研究，575277-80；O’Reilly等人(1994)冷泉港，Symp.Quant.Biol.59471-82；O’Reilly，M.S.，(1997)Exs.79273-94；Sim等人(1997)癌症研究.571329-34；Wu等人(1997)生物化学，生物物理，研究，交流236651-54)。目前，O’Reilly等人((1997)细胞88277-85)从鼠血管内皮瘤细胞系(EOMA)中分离的了内抑制素(endostatin)，一种血管生成抑制剂。在患有慢性肾衰但没有可检测到的肿瘤的患者中已检测到人类内抑制素片段的循环量，但这个片段含有缺失，没有抗-血管生成活性(Standker等人(1997)FEBSLETT.420129-33)。内抑制素的氨基端序列与胶原质XVIII的羧基段部分对应。内抑制素是内皮扩增和血管生成的特异抑制剂。在Eschericha coli中表达的非重折叠沉淀蛋白质的系统用药会在异种移植物模型中产生Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、B16恶性黑素瘤和EOMA细胞的生长退化(O’Reilly等人(1997)细胞88277-85)。并且，在所研究的三种肿瘤类型中没有抗药记录。对内抑制素重复周期用药已报道会致使肿瘤休眠(Boehm等人(1997)自然390404-407)。这些研究得到的结果给治疗癌症带来了新方法，并为克服常在化疗期间可观察到的抗药性提供令人鼓舞的方法。然而，在所有这些研究中，抑制剂蛋白质的非重折叠沉淀形式是以悬浮态给肿瘤携带动物服用的。此外，需要大量的蛋白质产生肿瘤退化及致使肿瘤休眠。如Kerbel所指出的((1997)自然390335-36)，需要口服这些蛋白质的等同物。如果可获得可溶解态的这些蛋白质重组形式，那么就可进行理论研究。并且，在活体内条件下研究其功效之前，可用溶解蛋白质在体外进行初始试验。此外，还报道尽管这些蛋白质有很大希望，但由于制备充足蛋白质进行试验有很大困难及有关它们抗血管生成性能的不一致结果(King，R.T.(1998)华尔街J，.第一页11月12日；Leff，D.N.(1998)今日生物世界91，10月20日)，使得评价它们的临床潜力受到阻碍。目前明显地存在需要一种制备大量可溶解形式的抗血管生成蛋白质的方法，并且其在体内和体外都有可靠的性能。本专利技术的简述描述了一种新型抗血管生成蛋白质，静息蛋白(restin)，以及其片段，突变体，衍生物和融合蛋白质。静息蛋白是胶原质XV的C-末端的蛋白片段，约20kDa。一个称作“apomigren”的片段，被发现其抗血管生成活性等于或超出内抑制素(endostatin)的抗血管生成活性。还描述了高效价表达蛋白质的方法。本专利技术涉及发现分离的抗血管生成肽，称作“静息蛋白”，和其片段，称作“apomigren”。静息蛋白包括约170到约200个氨基酸残基，并且有至少70％的序列与人类胶原质XV的α1链的NC10域的C末端一致。Apomigren是静息蛋白的一个片段，包括最后80到90个邻接氨基酸与人类胶原质XV的α1链的NC10域的C末端对应。本专利技术还包括分离的编码静息蛋白和apomigren的多聚核苷酸，互补序列和杂化本文描述序列的序列，与表达序列可实施连接的序列，及用这样的构建转化的宿主细胞。还公开了静息蛋白和apomigren的抗体。本专利技术还涉及制备静息蛋白和apomigren，含静息蛋白和apomigren的融合蛋白质，以及含静息蛋白和apomigren的组合物或其融合产物的方法。本专利技术还公开了制备编码静息蛋白和apomigren的多肽的方法。此外，本专利技术包括抑制哺乳动物组织内血管生成活性的方法，包括用含静息蛋白和apomigren的组合物接触组织，特别抑制产生在许多疾病和病状中的血管生成，包括癌症。本专利技术还公开了使用静息蛋白和apomigren诱导细胞程序死亡，或EM1的抗体阻止细胞程序死亡。本专利技术进一步公开在基因治疗法中使用静息蛋白和apomigren。靶细胞可以是任何哺乳动物细胞，具体地是淋巴细胞，血细胞，TIL细胞，骨髓细胞，脉管细胞，肿瘤细胞，肝细胞，和成纤维细胞。本专利技术的示图简介附图说明图1是静息蛋白核苷酸序列示图(SEQ ID NO)。图2是静息蛋白氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的静息蛋白，其包括含约１７０到约２００个氨基酸残基的氨基酸序列，至少７０％的序列与人类ＸＶ类胶原质的α１链的ＮＣ１０域的Ｃ－末端一致，其中分离的静息蛋白特点为具有抗－血管生成活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：维卡斯P萨克哈特姆，
申请(专利权)人：贝斯以色列护理医疗中心，
类型：发明
国别省市：US[美国]