一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法技术

本发明专利技术提供一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法。该方法首先通过免疫磁珠特异性结合待测蛋白质，接着加入免疫脂质体并形成免疫磁珠‑待测蛋白质‑免疫脂质体复合物，然后进行磁性分离并对免疫脂质体进行破膜，最后应用LAMP扩增脂质体释放出的DNA而实现蛋白质的超敏检测。本发明专利技术提供的检测方法具有特异性高、灵敏度高、简便快速和易于操作等优点，可广泛用于生物医学领域各种蛋白质尤其是低丰度蛋白质的检测。

An immunliposome LAMP method for protein hypersensitivity detection

The present invention provides an immune liposome LAMP method for protein hypersensitivity detection. The method begins by immunomagnetic specific binding protein to be detected, then add the immunoliposomes and form immunomagnetic protein to be tested immune liposome complexes, followed by magnetic separation and rupture of membrane on immune liposome, ultra sensitive detection using LAMP amplification of liposome release DNA protein. The detection method provided by the invention has the advantages of high specificity, high sensitivity, simplicity and speed, and easy operation. It can be widely applied to the detection of various proteins, especially low abundance proteins in biomedicine.

【技术实现步骤摘要】
一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及各种蛋白质的超敏检测，具体为一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法。
技术介绍
蛋白质是生命活动得以实现的最关键的生物分子，生物体内蛋白质类型和含量的变化往往反映出生命活动状态的改变，因此蛋白质的检测是生命科学和医学领域里最基本的一种研究分析手段。在各种生物标本中，蛋白质的类型和含量往往差别较大，有些蛋白质含量丰富，而有些蛋白质则含量甚微。蛋白质的含量与其功能有关，但不代表含量低的蛋白质就不能发挥生理功能，现在我们已证实很多微量蛋白质在生物的各种生命活动中发挥着非常重要的作用，所以痕量蛋白质检测不仅在基因功能分析等基础性研究中有着重要作用，而且在疾病的诊断、治疗和预后等临床活动中也有着十分重要的意义。蛋白质的检测根据检测的特异性可分为总蛋白的检测和特异蛋白质检测。总蛋白的检测是非特异性，通常是根据各种蛋白质共有的特性(如含氮量)来进行检测，目前常用的总蛋白检测方法包括凯氏定氮法、紫外吸收法、染料法和双缩脲法等。此外，还有针对白蛋白或球蛋白的检测方法，如检测白蛋白的溴甲酚绿法和溴甲酚紫法，检测球蛋白的乙醛酸法等。特异蛋白质检测指某种蛋白质的检测，通常采用特异性抗体或其它特异结合物来进行检测，目前常用的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法、电化学法和荧光免疫法等。痕量蛋白质的检测一般指某种特定蛋白质的检测，其检测方法也可称为蛋白质超敏检测方法，目前常用的蛋白质超敏检测方法包括超敏ELISA、免疫PCR、纳米探针技术、化学发光法和放射免疫分析法等。超敏ELISA和化学发光法的灵敏度虽然高于普通的蛋白质检测方法，但是其分析灵敏度远不如它超敏检测方法；放射免疫分析法灵敏度较好，但因使用放射性元素而逐渐被其它方法所取代；免疫PCR通过将蛋白质检测转换为核酸检测，显著提高了蛋白质检测的灵敏度，但因标记的核酸初始时即暴露于反应体系中，容易产生较高的本底值而影响检测的准确度；纳米探针技术以纳米粒子共振光散射体系为基础实现蛋白质的超敏检测，虽然具有操作简便、灵敏度高和利于后续分析等优点，但是纳米粒子的制备过程中影响因素较多，因此该技术检测痕量蛋白质的稳定性和重复性尚不够理想。鉴于上述现有的蛋白质超敏技术都存在某些方面的不足，研发一种新的简便、快速、灵敏和准确的痕量蛋白质检测新方法迫在眉睫。脂质体是一种主要由脂类构成的纳米颗粒，其脂质双分子层结构与生物体的细胞膜类似，脂质层外表面可进一步连接蛋白质、核酸等其它分子，其包裹的核心可容纳酶类、核酸、染料和药物等各种物质，因此脂质体作为一种药物载体在药物研发应用中发挥了十分重要的作用。另一方面，脂质体作为一种信号转换和放大载体在各种检测方法的构建中也起到了非常关键的作用。因此，如果用免疫脂质体包裹DNA，那么就能够将蛋白质检测转换为DNA检测，再通过后续具有超强信号放大能力的核酸扩增技术，就能够很好地实现各种蛋白质的超敏检测，而这正是本专利技术所要研发的新痕量蛋白质检测方法的理论假设。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于提供一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，该方法可用于细胞培养液、血液、脑脊液等标本中微量蛋白质的准确检测。本专利技术提供方法的基本原理是(如图1)：用抗靶蛋白的抗体1标记磁珠制备免疫磁珠，用抗靶蛋白的抗体2标记包裹DNA的脂质体制备免疫脂质体；在待测标本中先后加入免疫磁珠和免疫脂质体，待测标本中的靶蛋白会先后与免疫磁珠和免疫脂质体形成免疫磁珠-靶蛋白-免疫脂质体复合物，接着进行磁性分离并加入破膜剂破坏脂质体膜，然后对脂质体释放出的模板DNA进行等温扩增；在固定时间内扩增产物量与模板DNA量成正比，而模板DNA的量则与待测标本中的靶蛋白含量成正比，也即是扩增产物量与待测靶蛋白的量成正比，这样通过检测扩增产物量就可以计算出待测标本中靶蛋白的含量。具体而言，为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)免疫磁珠-待测蛋白质复合物的形成：取待测标本(血清、细胞培养液等)于微量离心管中，加入混匀的免疫磁珠，室温放置20-40min后即可形成免疫磁珠-待测抗原复合物；(2)免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物的形成：向步骤(1)中形成的免疫磁珠-待测抗原复合物中加入免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置20-40min，形成免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物；(3)磁性分离：将微量离心管放置在磁力架上2-10min进行磁吸附，然后用移液器吸走管内液体；(4)人工破膜：向微量离心管中加入破膜剂，脂质体破坏后释放出包裹的DNA模板；(5)LAMP检测：取适量DNA模板进行LAMP检测，通过分析模板DNA的量来确定标本中待测蛋白质的含量。优选地，步骤(1)所述的免疫磁珠由能特异性结合待测蛋白质的抗体和羧基化磁珠偶联形成。优选地，步骤(2)所述的免疫脂质体由能特异性结合待测蛋白质的抗体和脂质体膜嵌合形成。优选地，步骤(4)所述的破膜剂为Triton-X-100。优选地，步骤(5)所述的免疫脂质体包裹的DNA为斑马鱼细胞周期蛋白A1编码基因部分序列。优选地，步骤(5)所述优选的LAMP检测引物组包括的引物如下：外引物F3:5’-CCGAGAATGAGCAGCATAA-3’(SEQIDNo:1)；外引物B3:5’-CTTCTTCATCAGCCAATGAATG-3’(SEQIDNo:2)；内引物FIP:5’-ACAGTGGCTGTCTCAATCACACTCCAGGAGGTGTCTAAGC-3’(SEQIDNo:3)；内引物BIP:5’-TCCAACATTATTAGTGTTCGCTTCCAACACAAGAACACGAG-3’(SEQIDNo:4)；环引物LF:5’-TCACCAATTGACGCTCTGAA-3’(SEQIDNo:5)；环引物LB:5’-CTGCTAGTACTCGACGATGC-3’(SEQIDNo:6)。所述的LAMP检测可采用两种方式进行，即蛋白质定量检测时采用荧光检测方式，蛋白质定性检测时采用肉眼观察方式；荧光检测方式需在反应体系中加入SYBRgreen荧光染料，肉眼观察方式需在反应体系中加入钙黄绿素。所述的LAMP检测扩增条件为：63℃等温反应60min进行扩增，然后90℃等温反应2min终止反应。所述的LAMP检测结果通过分析荧光定量PCR仪的实时荧光检测数据来进行判断，或通过观察PCR管内液体颜色的变化来判断结果。肉眼观察结果，橙色为扩增阴性，黄绿色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果。与现有一些方法相比，本专利技术的有益效果如下：(1)操作简便：试验过程与ELISA类似，但无需进行多次洗板；等温扩增无需PCR仪等特殊设备；(2)检测快速：抗原抗体反应整个过程只需60min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2.5h以内。(3)高特异性：采用双抗体夹心方式来特异检测靶蛋白，反应不会受到白蛋白、免疫球蛋白等血清高丰度蛋白的影响。(4)高灵敏性：能检测出的最低值可达fg/mL，为ELISA方法的1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)免疫磁珠‑待测蛋白质复合物的形成：取待测标本于微量离心管中，加入混匀的免疫磁珠，室温放置20‑40min后即可形成免疫磁珠‑待测抗原复合物；(2)免疫磁珠‑待测蛋白质‑免疫脂质体复合物的形成：向步骤(1)中形成的免疫磁珠‑待测抗原复合物中加入免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置20‑40min，形成免疫磁珠‑待测蛋白质‑免疫脂质体复合物；(3)磁性分离：将微量离心管放置在磁力架上2‑10min进行磁吸附，然后用移液器吸走管内液体；(4)人工破膜：向微量离心管中加入破膜剂，脂质体破坏后释放出包裹的DNA模板；(5)LAMP检测：取适量DNA模板进行LAMP检测，通过分析模板DNA的量来确定标本中待测蛋白质的含量。

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)免疫磁珠-待测蛋白质复合物的形成：取待测标本于微量离心管中，加入混匀的免疫磁珠，室温放置20-40min后即可形成免疫磁珠-待测抗原复合物；(2)免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物的形成：向步骤(1)中形成的免疫磁珠-待测抗原复合物中加入免疫脂质体复合物，轻轻混匀后室温放置20-40min，形成免疫磁珠-待测蛋白质-免疫脂质体复合物；(3)磁性分离：将微量离心管放置在磁力架上2-10min进行磁吸附，然后用移液器吸走管内液体；(4)人工破膜：向微量离心管中加入破膜剂，脂质体破坏后释放出包裹的DNA模板；(5)LAMP检测：取适量DNA模板进行LAMP检测，通过分析模板DNA的量来确定标本中待测蛋白质的含量。2.根据权利要求1所述的用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，步骤(1)所述的免疫磁珠由能特异性结合待测蛋白质的抗体和羧基化磁珠偶联形成。3.根据权利要求1所述的用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，步骤(2)所述的免疫脂质体由能特异性结合待测蛋白质的抗体和脂质体膜嵌合形成。4.根据权利要求1所述的用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，步骤(4)所述的破膜剂为Triton-X-100。5.根据权利要求1所述的用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方法，其特征在于，步骤(5)所述的免疫脂质体包裹的DNA为斑马鱼细胞周期蛋白A1编码基因部分序列。6.根据权利要求5所述的用于蛋白质超敏检测的免疫脂质体LAMP方...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡慧娜，
申请(专利权)人：蔡慧娜，
类型：发明
国别省市：广东,44