用于检测食道癌的组合物及其试剂盒和用途制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测食道癌的组合物，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂。通过对目标基因的甲基化状态和目标基因的蛋白表达水平来检测食道癌。本发明专利技术还提供了包括所述组合物的试剂盒。以及一种对食道癌进行体外检测的方法。因此，本发明专利技术利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段的检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，进一步地，本发明专利技术通过检测待测样品中SNCG蛋白的浓度，提供了一种准确的体外检测方法。

Composition, kit and use for detecting esophageal cancer

The present invention provides a composition for the detection of esophageal cancer, comprising: 1) for nucleic acid detection, target gene at least one region of the methylation status of the gene as the target gene or fragment SEPT9 and / or SNCG gene or fragment thereof; and 2) reagent for expression SNCG protein was detected in the serum. Cancer of the esophagus is detected by the methylation status of the target gene and the protein expression level of the target gene. The invention also provides a kit for the composition. And a method for the detection of esophageal cancer in vitro. Therefore, the method of real-time PCR analysis of plasma samples of DNA, can be easily realized by targeting the SEPT9 gene or its fragments and / or SNCG gene or fragment detection, and according to the real-time PCR cycle threshold (Ct) value to quickly and easily determine whether the sample is positive, further. The present invention by detecting the concentration of SNCG protein in the sample provides an accurate detection method in vitro.

【技术实现步骤摘要】
用于检测食道癌的组合物及其试剂盒和用途
本专利技术属于生物
，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测食道癌的组合物及其相应的试剂盒和用途。
技术介绍
癌症是一类严重危及公共健康的疾病。世界卫生组织下属的国际癌症研究机构公布的有关全球癌症状况的最新数据(GLOBOCAN2012)显示：2012年全球新增约1,410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万；与2008年的数据相比，2012年新增癌症病例增加11％，癌症死亡人数增加8.3％。该机构根据现有数据预计，由于全球人口增长和老龄化，到2025年前，全球每年新增癌症病例数将高达1,930万例。由于近年来人口老龄化和人们生活方式的改变，我国的癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。2013年全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》的数据显示：中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升；预计到2020年，中国每年的癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。食道癌是我国一种高发恶性肿瘤疾病。全国肿瘤防治办公室数据显示：2015年，我国食道癌新发病例47.8万人，死亡37.5万人，新发病例位居我国常见癌症的第三位，死亡病例位居我国常见癌症的第四位。食道癌的病死率(death-to-caseratio)接近80％，是一种恶性程度较高的癌症。造成食道癌死亡率较高的一个重要因素是早期食道癌的确诊率低。早期食道癌缺乏明显和特异性的症状，绝大部分患者确诊时属于晚期，病灶多已发生转移。临床研究发现，从食道癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要几年时间，这为发现早期食道癌、提高早期食道癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率。目前用于食道癌诊断的技术在早期食道癌的检测和筛查方面的应用非常有限：1)影像学检测技术(食道镜、CT、MRI等)设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；2)组织活检的侵入性强，不适于早癌的筛查；3)常用消化道肿瘤血清标识物(如：CEA、CA125、CA199和AFP等)作为食道癌的无创检测方法的灵敏度很低，无法满足临床检测需要。因此，开发灵敏、特异的新型食道癌标识物和检测技术是提高食道癌早癌检出率、改善食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率的重要途径。多年研究证明表观遗传学在癌症的发生、发展中起着极其重要的作用。作为表观遗传学的一种重要机制，DNA甲基化/去甲基化在多种肿瘤(肠癌、胃癌、肺癌等)中的调控得到了深入的研究。大量研究显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关联；细胞基因甲基化/去甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化和致癌基因的去甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。研究证明，SEPT9基因在癌症如大肠癌、肺癌、胃癌等的细胞中，发生DNA甲基化，抑制SEPT9基因的表达，进而促进癌症的发生和发展；SNCG基因在癌症如乳腺癌、卵巢癌、胃癌的细胞中，发生DNA去甲基化，激活SNCG基因的表达，进而促进癌症的发生和发展。然而，现有技术中，并没有将SEPT9基因和SNCG基因联合用于食道癌检测的相关研究或报道。
技术实现思路
因此，针对现有技术存在的对食道癌患者检测中存在的确诊率低的问题，本专利技术的目的是提供一种用于检测食道癌的组合物，本专利技术提供的组合物能够敏感和特异性地检测早期食道癌；本专利技术还提供了包含所述组合物的试剂盒以及其在检测食道癌中的用途。本专利技术提供了一种用于体外检测食道癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于体外检测食道癌的组合物，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段，和/或SNCG基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂。通过目标基因的甲基化状态以及目标蛋白的表达水平来检测食道癌。根据本专利技术的某些优选的实施方案，所述组合物包括用于检测SEPT9基因或其片段，和SNCG基因或其片段的每一个的至少一个区域内甲基化状态的核酸。通过对目标基因的甲基化检测结果来检测食道癌。优选地，所述SEPT9基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段，其中包含至少一个CpG二核苷酸序列；所述SNCG基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段，其中包含至少一个CpG二核苷酸序列；CpG的甲基化状态表明所述疾病的检测结果。优选地，用于检测SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段中至少一个区域内甲基化状态的核酸序列包括：等同于或互补于来自SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少9个碱基长的连续序列片段，或在中等严紧或严紧条件下杂交于来自SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少9个碱基长的连续序列片段；优选地，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。优选的试剂是亚硫酸氢盐。优选地，所述用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂为酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)试剂；其中，所述试剂包括SNCG蛋白的特异性抗体；更优选的，所述试剂为“三明治式”酶联免疫吸附试剂；进一步优选地，所述试剂包括SNCG蛋白的特异性抗体包被的反应板、SNCG蛋白酶结合物、底物液、洗液和终止液。根据本专利技术的第二个方面，还提供了包括所述组合物的试剂盒。典型地，所述的试剂盒还包括用于容纳受试者生物样品的容器。并且，所述的试剂盒还包括使用和解释试剂盒结果的说明。根据本专利技术的第三个方面，还提供了一种对食道癌进行体外检测的方法，所述方法包括以下步骤：1)分离待测生物样品中目标基因的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段；2)检测所述目标基因中至少一个区域内的甲基化状态；3)检测SNCG蛋白在待测生物样品的血清中的表达水平；优选地，使用ELISA方法检测；4)通过所述目标基因的甲基化检测结果和蛋白水平检测结果对食道癌进行体外检测。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)分离待测生物样品中的目标基因，其中所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段；2)确定所述目标基因的每个的至少一个区域内的甲基化状态；3)检测SNCG蛋白在待测生物样品的血清中的表达水平；4)通过所述目标基因的甲基化检测结果和蛋白水平检测结果对食道癌进行体外检测。根据某些优选实施方案，所述方法还包括以下步骤：1)使用试剂将目标基因的5’位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面是可检测的；2)将经步骤1)处理过的目标基因与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因被扩增以产生扩增产物或不被扩增；3)用探针检测扩增产物；以及4)基于所述扩增物是否存在，确定所述目标基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于体外检测食道癌的组合物，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段，和/或SNCG基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种用于体外检测食道癌的组合物，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段，和/或SNCG基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括用于检测SEPT9基因或其片段，和SNCG基因或其片段中的每一个的至少一个区域内甲基化状态的核酸；优选地，所述SEPT9基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段，其中包含至少一个CpG二核苷酸序列；所述SNCG基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段，其中包含至少一个CpG二核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述用于检测SEPT9基因或其片段，和/或SNCG基因或其片段中的每一个的至少一个区域内甲基化状态的核酸的序列等同于或互补于来自SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少9个碱基长的连续序列片段，或在中等严紧或严紧条件下杂交于来自SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少9个碱基长的连续序列片段。4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述核酸为探针或引物；优选地，所述探针或引物包含等同于、互补于来自SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少15个连续核苷酸的片段或其互补序列，或在中等严紧或严紧条件下杂交于来自SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2的至少15个连续核苷酸的片段或其互补序列；更优选地，所述探针或引物为选自以下的核酸序列：SEPT9引物F1:SEQIDNO：3：CCCACCAACCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马竣，韩晓亮，王建铭，
申请(专利权)人：博尔诚北京科技有限公司，博诚研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11