麻疹病毒L4株比Edmonston株具有更高的血溶活性,本发明专利技术从麻疹病毒L4株克隆了融合蛋白F基因,发现该基因的DNA序列中有七个碱基与文献报道的Edmonston株融合蛋白F基因的DNA序列不同,并导致这两种毒株的融合蛋白氨基酸序列间两个氨基酸不同,该麻疹病毒L4株融合蛋白F基因在重组痘苗病毒天坛株载体中表达后具有高滴度血溶活性,免疫后产生高滴度血溶抑制抗体。本发明专利技术可用于麻疹病毒生物学、分子生物学和基因工程麻疹疫苗的研究与开发。(*该技术在2014年保护过期,可自由使用*)
【技术实现步骤摘要】
本专利技术总的涉及基因工程技术,特别是涉及麻疹病毒的重组DNA基因工程疫苗。麻疹是严重危害人类健康的传染病,已在世界范围内纳入儿童计划免疫。三十多年来,麻疹减毒活疫苗的广泛应用虽然已成功地控制了麻疹大规模流行,但始终未能彻底消灭麻疹,麻疹局部暴发流行的情况常有发生,在一些国家和地区麻疹仍是造成婴儿死亡的重要原因。据世界卫生组织估计,全世界每年因麻疹死亡的人数约100-150万。造成这一情况的重要原因之一是现有的麻疹减毒活疫苗存在着免疫不全面,免疫持久性不够,加强免疫效果不理想以及不能早期(出生后6个月内)使用等问题,使用基因工程麻疹疫苗是解决上述问题的重要途径。近年来麻疹基因工程疫苗,特别是在麻疹病毒保护性抗原基因克隆及表达的研究中已获得多方面的进展。1986年Alkhatib等首先公开了麻疹病毒Edmonston株血凝素(HA)基因的克隆与DNA序列。序列分析表明,该基因由1854个碱基对(bp)组成,编码617个氨基酸(图1)。同年Gerald等从麻疹病毒Halle’株克隆了HA基因,并与Edmonston株的DNA序列进行了比较,结果显示两毒株有13个bp不同,并导致8个氨基酸变异。1986年Richardson等公开了Edmonston株融合蛋白(F)基因的克隆和DNA序列,序列分析结果表明最长一个开放读码框架的F基因由1662个bp组成,编码553个氨基酸(图2)。1987年Bucklan等克隆了Halle’株的F基因,并与Edmonston株的序列进行了比较,发现二者有4个bp不同,但未导致氨基酸的变异。在基因工程麻疹疫苗研究中主要使用Halle’株或Edmonston株的HA和F进行。至今尚未见对麻疹病毒L4株HA和F基因进行克隆和序列分析的报导。1988年,Drillien等在痘苗病毒中分别表达了麻疹病毒HA和F基因。其特点是HA和F基因均来自Halle′毒株,载体病毒为痘苗病毒哥本哈根株,HA和F基因均使用痘苗病毒7.5K蛋白启动子驱动,并分别在不同重组毒株的TK基因区单独表达。表达HA或表达F的重组痘苗病毒免疫BalB/c小鼠后均能产生对致死剂量的亚急性硬化性脑脊髓膜炎麻疹毒株的脑内攻击保护。重组痘苗表达的HA和F的理化性质及在感染细胞内的分布与麻疹病毒细胞感染后的相似。1992年,wild等构建了在同一区能同时表达麻疹病毒HA和F的重组痘苗病毒。其特点是HA和F基因均来自Halle′株,两基因头对头相连,其上游均分别使用7.5K启动子驱动,表达区为痘苗病毒TK区(图3)。病毒重组使用了痘苗病毒哥本哈根株的温度敏感突变株VVts7,先在鸡胚细胞中重组,然后在Ltk细胞中根据TK性状选择重组痘苗病毒。与单独表达HA或F的重组病毒的比较资料表明,每一种方式表达HA的分子量均约为80KD,F的分子量则有三种,60KD,40KD和20KD,分别与未裂解的F0,裂解后的F1和F2相对应。HA和F同时表达的重组痘苗病毒产生更好的免疫效果。1991年,Wild等已先期报导了使用上述结构同时表达HA和F可以在感染细胞上产生与麻疹病毒感染后引起的类似的融合病灶。1990年,Spehner等的结果表明,在TK区使用7.5K启动子在同一个方向顺序表达Lac-Z和F基因造成F基因在病毒传代中丢失现象,但将Lac-Z和F头对头(与上述Wild等的结构相似)表达时(见图4),F的表达量下降约50%。目前文献报导的同时在痘苗病毒中同一区域表达HA和F基因的结构都存在干扰外源基因表达的不利影响。1992年,Taylor等报导了在金丝雀痘病毒不同区,同时表达麻疹病毒HA和F的重组病毒。其特点是HA和F基因均来自麻疹病毒Edmonston株,两基因均分别受痘苗病毒H6启动子控制,并同时在金丝雀痘病毒基因组pVUII的3.4K片段和0.9K片段两个区获得表达。病毒重组在鸡胚细胞中进行,首先将F基因送到金丝雀痘病毒基因组pVUII的3.4K片段,获得表达F基因的重组vCP40,再用vCP40与HA基因重组,将HA送到该病毒pVUII的0.9K片段,获得HA和F同时表达的重组病毒vCP57,在使用该病毒免疫时,获得了与表达HA和F的重组痘苗病毒免疫后产生的相同的免疫保护效果。该病毒已开始进行小剂量人体免疫观察。如前所述,近年来麻疹基因工程疫苗的研究已取得很大进展,特别是使用痘苗病毒为载体进行的基因工程麻疹疫苗的研究展现了较好的前景。但是现有麻疹病毒HA和F基因克隆的免疫效果不够好,同时表达HA和F基因的结构不合理,重组病毒的筛选与纯化方法较复杂,痘苗病毒株的选用亦尚待确定。为了克服上述现有技术中的不足之处,本专利技术的目的1、选择麻疹病毒L4株为出发株,以获得更好免疫效果的麻疹病毒HA和F基因。2、组建新的表达结构,以获得麻疹病毒HA和F基因在重组痘苗病毒同一区域中高效表达。3、建立一套简单有效的获得同时表达麻疹病毒HA和F基因的重组痘苗病毒人用疫苗株的重组、筛选、纯化和毒种制备方法。4、使用痘苗病毒天坛株为亲本株,构建同时表达麻疹病毒HA和F基因并能够用于人体免疫观察的安全、有效的重组痘苗病毒人用疫苗株。本专利技术的目的能通过以下方法来实现从麻疹病毒L4株中克隆具有良好生物学性状及免疫效果的HA和F基因,构建能够将HA和F基因转入重组痘苗病毒同一个区域尾对尾高效表达的重组质粒,利用融合性状建立一套简单有效的适用于麻疹病毒HA和F基因同时在重组痘苗中表达的病毒重组、筛选、纯化及制备方法,并通过该方法将重组质粒与痘苗病毒人用疫苗株-天坛株重组,获得能够高效、稳定表达麻疹病毒HA和F基因的安全、有效的重组痘苗病毒疫苗毒株。本专利技术的优点在于获得的表达麻疹病毒HA和F的重组痘苗病毒在外源基因、表达结构、重组病毒的筛选与纯化方法及选用的痘苗病毒毒株四个主要方面比现有技术有明显的改进,具有刨造性和实用价值。它简化了重组病毒筛选和纯化的方法,提高了获得重组病毒的机率,所获得的表达HA和F基因的重组痘苗病毒天坛株表达水平高,免疫效果好,毒力低,遗传性状稳定,是可用于人体免疫观察的基因工程麻疹疫苗毒株。下面结合附图对本专利技术作进一步详述(一)麻疹病毒L4株血凝素(HA)和融合蛋白(F)基因克隆的DNA序列特点1、麻疹病毒L4株。该毒株是在中国广泛应用的麻疹减毒活疫苗株“长-47”的亲本株,在苏联列宁格勒分离获得,并于五十年代引入中国。该毒株先用人胚肾细胞传26代后,再在人羊膜细胞上传代,是部分减毒毒株,比Edmonston等毒株具有更好的血凝和血溶活性(表一)。本专利技术使用的毒种为人羊膜72代,由中国药品和生物制品检定所提供。表一、不同麻疹毒株血溶和血凝活性比较毒株 血溶活性血凝滴度(以O.D540m表示)L4 0.529 1∶128Edmonston0.143 1∶15CAM -0.025 1∶1长47 -0.017 1∶1沪191 0.003 1∶1细胞对照 0.000 -2、麻疹病毒L4株HA和F基因的克隆和DNA序列特点用麻疹病毒L4株克隆到HA和F基因(详细程序见实施例1),进行了基因DNA序列测定,并与Edmonston株的相应序列进行了比较(见图1、2和表二)。HA基因的DNA序列全长1854本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种麻疹病毒L4株的融合蛋白F基因,其特点是:基因的DNA序列全长1662个碱基对,编码553个氨基酸,其DNA序列中第194、255、734、966、1098、1311、1575位的七个碱基与文献报道的Edmonston株融合蛋白F基因的DNA序列不同,并导致这两种毒株的融合蛋白氨基酸序列间两个氨基酸不同,分别为第65位的异亮氨酸Ile变异为苏氨酸Thr,第245位的异亮氨酸Ile变异为苏氨酸(Thr)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:阮力,朱既明,杨克俭,徐水婵,朱诚,
申请(专利权)人:中国预防医学科学院病毒学研究所,
类型:发明
国别省市:11[中国|北京]
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