抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体其制备及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有抗体活性的抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体（抗－ＨＰＴｘＩｇＹ）、制备抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体的方法及抗－ＨＰＴｘＩｇＹ在制备用于治疗因幽门螺杆菌感染引起的相关疾病药物或保健品中和在制备用于检测因幽门螺杆菌感染引起的相关疾病的制剂中的应用。上述抗体经ＩｇＹ纯度检查：用ＰＡＧＥ电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带；用紫外分光光度计进行测定以计算出蛋白浓度（ｍｇ／ｍｌ）为：（１．４５×ＯＤ↓［２８０ｎｍ］－０．７４×ＯＤ↓［２６０ｎｍ］）×稀释倍数。上述方法为：制备幽门螺杆菌细胞毒素抗原，将该抗原免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗－ＨＰＴｘＩｇＹ。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及了一种具有抗体活性的卵黄抗体产品-抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体，并涉及其准备工艺及在药学上的应用。(二)、技术背景幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是近二十年来发现的与慢性胃炎、消化性溃疡和非溃疡性消化不良的发生密切相关的致病菌。WHO将其列为I类致癌因子，HP可产生多种具有细胞毒活性的蛋白分子，它在胃黏膜粘附定植后，释放出VacA(空泡毒素)、CagA(细胞毒素样蛋白)等毒素使胃黏膜上皮坏死和引起炎症反应。故细胞毒素分子在HP致病过程中起着重要的作用。目前，因HP感染的相关疾病，例如慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等。HP的治疗措施一直是人们关注的领域，目前，临床上预防和治疗幽门螺杆菌感染的方法，一般多采用联合药物方案，常用的如铋剂+硝基咪唑类抗生素+四环素，质子泵阻滞剂+新大环内脂类抗生素，长期使用会产生抗生素耐药菌株及变异株给进一步治疗造成困难并且抗生素的长期使用会给予病人带来其它的副作用。而且，在我国因动物模型的限制，HP菌苗研究进展缓慢。因此采用被动免疫保护是防治HP感染的一条新途径。现有技术中未见有通过采用幽门螺杆菌细胞毒素抗原，免疫健康母鸡，收集其所产的卵，再从卵中提取抗—HPTxIgY方法的报道。(三)、专利技术的内容本专利技术所要解决的技术问题之一是针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有抗体活性的抗幽门螺杆菌细胞毒素鸡卵黄抗体(抗—HPTxIgY)。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供上述抗幽门螺杆菌鸡卵黄抗体的制备方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是提供上述抗幽门螺杆菌细胞毒素卵黄抗体在制备用于因感染幽门螺杆菌引起的相关疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡和非溃疡性消化不良及胃癌等疾病的预防或治疗的药物制剂或保健品应用，以及在制备用于幽门螺杆菌的临床诊断或检测的检测试剂的应用。本专利技术解决上述技术问题之一所提供的抗幽门螺杆菌细胞毒素卵黄抗体即抗—HPTxIgY，其特征在于所述抗—HPTxIg按YSDS-PAGE电泳(7.5％分离胶)检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰R250染色呈蓝色；免疫印记Western-blotting检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；用紫外分光光度计进行双波长测定以计算出蛋白浓度(mg/ml)为(1.45×OD80nm-0.74×OD60nm)×稀释倍数。本专利技术解决上述技术问题之二是通过采用这样的技术方案实现的，即一种制备抗幽门螺杆菌毒素卵黄抗体的方法，其特征在于采用如下的步骤完成1、制备HP细胞毒素抗原(1)提取法分离得到产毒素的HP菌株，涂布于布氏琼脂上，37℃微需氧培养72h，得纯菌种后，在布氏肉汤培养基中扩大培养T2h。收集培养上清，通过超滤和层析分离得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得HP毒素抗原。或(2)合成法构建含有HP细胞毒素结构基因VacA或CagA的表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化，制备HP空泡毒素(VacA)和细胞毒毒素(CagA)，按重量比1∶1混合作为免疫抗原，加入等体积的福氏佐剂，乳化混匀得HP毒素抗原。2、将HP毒素抗原按以下的步骤制备抗体(1).对产卵母鸡的免疫选用产卵母鸡(健康)隔离饲养。进行鸡皮下多点注射，如五点，毒素蛋白量相当于1010CFU/ml细菌所产生。以后每两周加强免疫一次，共计免疫8次；于7天后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。(2).卵黄抗体的提取①.采用水溶法提取卵黄抗体。从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—HPTxIgY。或②采用膜过滤法提取卵黄抗体。分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD—200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—HPTxIgY。本专利技术所提供的上述抗—HPTxIgY产品由幽门螺杆菌细胞毒素免疫产卵母鸡而得，具有特异性，对防治幽门螺杆菌感染引起的相关疾病具有良好的效果。本专利技术采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化。(四)、附图的说明附图给出了本专利技术制备方法的工艺流程图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的实施例作进一步的说明本实施例1具有抗体活性的幽门螺杆菌细胞毒素卵黄抗体的产品，可以通过以下步骤获得制备幽门螺杆菌(HP)细胞毒素抗原，将HP毒素抗菌素抗原免疫健康母鸡，然后收集其所产卵，再从其所产卵中提取抗—HPTxIgY。实施例2HP细胞毒素抗原的制备，分离得到产毒素的HP菌株，涂布于布氏琼脂上，37℃微需氧培养72h，得纯菌种后，在布氏肉汤培养基中扩大培养T2h。收集培养上清，通过超滤和层析分离得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐剂，乳化得HP毒素抗原。实施例3构建含有HP细胞毒素结构基因VacA或CagA的表达质粒，在大肠杆菌系统中进行表达，表达产物经分离纯化，制备HP空泡毒素(VacA)和细胞毒毒素(CagA)，按重量比1∶1混合作为免疫抗原，加入等体积的福氏佐剂，乳化混匀得HP毒素抗原。实施例4采用如下方式分离提取抗—HPTxIgY从免疫鸡卵中分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，调整适当PH值4℃静置8h，离心取上清浓缩、冷冻干燥，得到抗—HPTxIgY。实施例5分离得蛋黄，以蒸馏水稀释，4℃静置12h后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD—200KD的蛋白物质，冷冻干燥得到抗—HPTxIgY。实施例6取实施例1、4、5中的产品进行IgY纯度检查用PAGE电泳检测纯化的卵黄抗体的纯度，电泳中只出现一条电泳带，即为提纯的卵黄抗体。实施例7取实施例1、4、5中的产品进行IgY浓度检查将提取的用PBS作5-10倍的稀释，然后用紫外分光光度计进行测定以计算出蛋白浓度。蛋白浓度(mg/ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀释倍数实施例8取实施例1、4、5中任何一种产品进行IgY效价测定采用奥氏双扩散方法进行IgY效价测定，IgY效价为1∶640-1∶25600。实施例9采集抗—HPTxIgY免疫蛋50个，分离得到800ml蛋黄，加水稀释至5000ml，离心得到清液4000ml，采用中空纤维超滤提取，最后浓缩至400ml待用，其中含有精提，(即指纯度在99.5％以上的IgY抗—HPTxIgY)8克。将异麦芽糖10克加入5ml水溶解，100℃灭菌30分钟，将处理过的辅料与50ml超滤液混合均匀，冷冻干燥，无菌粉碎包装成袋，每小袋内含0.5克，用于治疗因HP感染引起的慢性胃炎以及消化性溃疡。实施例10采集抗—HPTxIgY免疫蛋100个，得到1600ml蛋黄，加2倍PBS稀释液，并加入3.5％PEG6000搅拌静置2小时，离心得到清液3500ml，再加PEG6000至终浓度为12％，静置2小时，离心收集沉淀。以100ml蒸馏水溶解IgY沉淀，通过细菌过滤器除菌，冷冻干燥，以每个普通胶囊装200mg粗提抗—HPTxIgY进行灌装，所得产品用于预防HP感染，人体服用方法每天2-3次，每次3粒胶囊。实施例11抗—HPTxIgY体外拮抗毒素生物活性实验抗—HPTxIgY(10ug～200ug/ml)与HP毒素(30～90ug/ml)在无菌条件下1∶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ＨＰ毒素鸡卵黄抗体（抗－ＨＰＴｘＩｇＹ），其特征在于：述抗－ＨＰＴｘＩｇ按ＹＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳（７．５％分离胶）检测，图谱呈现单一区带；经电泳考马斯亮兰Ｒ２５０染色呈蓝色；免疫印记Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中高分子量带处出现清晰单一的特异性酶染条带；用紫外分光光度计进行双波长测定以计算出蛋白浓度（ｍｇ／ｍｌ）为：（１．４５×ＯＤ↓［２８０ｎｍ］－０．７４×ＯＤ↓［２６０ｎｍ］）×稀释倍数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈君，雁杰，
申请(专利权)人：重庆和润实业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]