用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组。所述引物组包括分别针对VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针。本发明专利技术涉及一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，还包括PCR buffer，dNTP、HS Taq酶及超纯水。本发明专利技术还涉及一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

Primer groups, kits and methods for the detection of VEGFR1 and VEGFR2 expression of tumor targeting drug related genes

The present invention relates to a primer group for detection of the expression of VEGFR1 and VEGFR2 related genes for tumor targeting drug. The primer groups include specific primers and probes for the VEGFR1 gene, the VEGFR2 gene and the reference gene Actin, respectively. The present invention relates to a kit for detection of the expression of VEGFR1 and VEGFR2 related genes for tumor targeting drug. The kit includes PCR reaction liquid, the PCR reaction solution including the detection of VEGFR1 gene, VEGFR2 gene and reference gene Actin specific primers and probes, including PCR dNTP, HS buffer, Taq enzyme and ultra pure water. The invention also relates to a method for detecting the expression of VEGFR1 and VEGFR2 for tumor targeting drug related genes. The kit and detection method provided by the invention has the advantages of simple operation, short detection time, high sensitivity and specificity, and is especially suitable for popularization and application in clinical laboratory work.

【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，特别的，涉及一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
血管生成是实体肿瘤细胞生长和转移的必要条件。血管内皮细胞生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)通过多种机制促进肿瘤血管生成与血流量增加，其结合并激活3种结构类似的Ⅲ型酪氨酸激酶受体即血管内皮细胞生长因子受体(VascularEndothelialGrowthFactorReceptor，VEGFR)，VEGFR家族包含有3种亚型，即VEGFR1(F1t-1)，VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR3(Flt-4)。其中VEGFR1调节肿瘤血管的生成并影响微血管的数量；VEGFR2参与介导对内皮细胞的增殖过程，诱导肿瘤血管的形成；VEGFR3可调节肿瘤淋巴管的形成。因此VEGF和VEGFR特别是VEGFR1和VEGFR2是抗血管生成靶向治疗的主要靶标。抑制肿瘤细胞诱导的血管生成是近年来寻找新型抗肿瘤药物的重要研究方向。贝伐单抗(Bevacizumab)是第1个VEGF靶向药物抗VEGF单克隆抗体，其药物作用机理主要是通过抑制肿瘤细胞介导的血管生成来达到阻止肿瘤的生长、转移和复发的目的。临床研究已证实，VEGFR可作为结肠癌病人使用贝伐单抗联合治疗方案临床疗效独立的预测因子：即VEGFR基因表达水平高的患者的中位无进展生存期较长，而VEGFR基因表达水平低的患者中位无进展生存期较短。目前FDA批准的此类药物还包括舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)。索拉非尼既能抑制Raf激酶，还能抑制VEGFR，包括VEGFR-2、VEGFR-3、血小板衍生生长因子(PDGFR)等。舒尼替尼是一种小分子TKI，能和VEGFR酪氨酸残基磷酸化后结合，抑制信号传导。有研究表明，肝癌患者在使用索拉非尼时，VEGFR表达较强者具有更好的治疗疗效。因此，VEGFRmRNA表达水平检测对患者接受靶向治疗有明显的指导意义。目前，在临床疾病标志物实际的检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等，技术普及性好、观察直观且相对传统，但存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大等缺点，一定程度上限制了该方法临床上的进一步应用。近年来，RealTime-PCR凭借检测时间短、检测敏感性高(是免疫组织化学染色法的10倍以上)，而且能对PCR进行实时在线检测，反应基因在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。常见方法有SYBRGreenI染料法、双探针杂交法及Taqman探针技术；其中SYBRGreenI法由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法及Taqman法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。综上所述，本专利技术采用TAQMAN探针技术与实时荧光PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。
技术实现思路
为了解决免疫组化法检测临床生物标志物时存在实验过程过于繁琐，需要试剂种类繁多，结果读取主观影响较大的技术问题，本专利技术提供一种操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好的用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组、试剂盒及方法。本专利技术提供了一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组，包括分别针对VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，如下：VEGFR1-RF上游引物：5'-AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC-3'(SEQIDNO.1)；VEGFR1-RR下游引物：5'-GTACGTGATGCATTGGGTGATC-3'(SEQIDNO.2)；VEGFR1-RP探针：5'FAM-CTGCTCCAACCCCCGCCACC-TRAMA-3'(SEQIDNO.3)；VEGFR2-RF上游引物：5'-AACCAGACAAGCGGCTACCA-3'(SEQIDNO.4)；VEGFR2-RR下游引物：5'-ACCGGTTTGCACTCCAATCTC-3'(SEQIDNO.5)；VEGFR2-RP探针：5'FAM-ATCACTCCGATGACACAGACACCACCG-TRAMA-3'(SEQIDNO.6)；Actin-RF上游引物：5'-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3'(SEQIDNO.7)；Actin-RR下游引物：5'-AGGATGGAGCCGCCGAT-3'(SEQIDNO.8)；Actin-RP探针：5'FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3'(SEQIDNO.9)。本专利技术还提供了一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，如下：VEGFR1-RF上游引物：5'-AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC-3'；VEGFR1-RR下游引物：5'-GTACGTGATGCATTGGGTGATC-3'；VEGFR1-RP探针：5'FAM-CTGCTCCAACCCCCGCCACC-TRAMA-3'；VEGFR2-RF上游引物：5'-AACCAGACAAGCGGCTACCA-3'；VEGFR2-RR下游引物：5'-ACCGGTTTGCACTCCAATCTC-3'；VEGFR2-RP探针：5'FAM-ATCACTCCGATGACACAGACACCACCG-TRAMA-3'；Actin-RF上游引物：5'-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3'；Actin-RR下游引物：5'-AGGATGGAGCCGCCGAT-3'；Actin-RP探针：5'FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3'；所述PCR反应液还包括PCRbuffer，dNTP、HSTaq酶及超纯水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述阳性对照品分别为含VEGFR1和VEGFR2基因的溶液；所述阴性对照品为不含VEGFR1和VEGFR2基因的溶液；所述空白对照品为超纯水。本专利技术还提供了一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的方法，包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提mRNA，将样本mRNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA作为模板；步骤二：提供上述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述模板混匀；步骤三：利用上述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并分别以VEGFR1和VEGFR2标准基因作为阳性对照构建标准曲线，根据样本的Ct值计算出样本的底物浓度；比较标准曲线上计算出正常样本与病变样本的底物浓度，最终判断待检测样本中的mRNA表达水平。在本专利技术提供的所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组，其特征在于，包括分别针对VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，如下：VEGFR1‑RF上游引物：5'‑AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC‑3'；VEGFR1‑RR下游引物：5'‑GTACGTGATGCATTGGGTGATC‑3'；VEGFR1‑RP探针：5'FAM‑CTGCTCCAACCCCCGCCACC‑TRAMA‑3'；VEGFR2‑RF上游引物：5'‑AACCAGACAAGCGGCTACCA‑3'；VEGFR2‑RR下游引物：5'‑ACCGGTTTGCACTCCAATCTC‑3'；VEGFR2‑RP探针：5'FAM‑ATCACTCCGATGACACAGACACCACCG‑TRAMA‑3'；Actin‑RF上游引物：5'‑CCGACAGGATGCAGAAGGAG‑3'；Actin‑RR下游引物：5'‑AGGATGGAGCCGCCGAT‑3'；Actin‑RP探针：5'FAM‑ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC‑TRAMA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的引物组，其特征在于，包括分别针对VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，如下：VEGFR1-RF上游引物：5'-AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC-3'；VEGFR1-RR下游引物：5'-GTACGTGATGCATTGGGTGATC-3'；VEGFR1-RP探针：5'FAM-CTGCTCCAACCCCCGCCACC-TRAMA-3'；VEGFR2-RF上游引物：5'-AACCAGACAAGCGGCTACCA-3'；VEGFR2-RR下游引物：5'-ACCGGTTTGCACTCCAATCTC-3'；VEGFR2-RP探针：5'FAM-ATCACTCCGATGACACAGACACCACCG-TRAMA-3'；Actin-RF上游引物：5'-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3'；Actin-RR下游引物：5'-AGGATGGAGCCGCCGAT-3'；Actin-RP探针：5'FAM-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TRAMA-3'。2.一种用于肿瘤靶向药相关基因VEGFR1和VEGFR2表达检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测VEGFR1基因、VEGFR2基因及参考基因Actin的特异性引物及探针，如下：VEGFR1-RF上游引物：5'-AATCCTTCCTAAACCCAATGACTTC-3'；VEGFR1-RR下游引物：5'-GTACGTGATGCATTGGGTGATC-3'；VEGFR1-RP探针：5'FAM-CTGCTCCAACCCCCGCCACC-TRAMA-3'；VEGFR2-RF上游引物：5'-AACCAGACAAGCGGCTACCA-3'；VEGFR2-RR下游引物：5'-ACCGGTTTGCACTCCAATCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广东大臻医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44