一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开的一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQ NO.1‑SEQ NO.396探针混合物，且每条探针之间的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl。本发明专利技术的试剂盒是基于二代测序技术的基因检测，可一次性检测3种变异类型(突变、插入缺失、融合)，同时应用高测序深度覆盖微量基因变异，从而在样本有限的前提下精准检测患者的突变情况，可准确检测1％的突变频率。一方面，多基因高敏感性的平行检测提升了可用药基因变异的检出率，不错失用药的机会；另一方面，可在一次检测中同时检出热点、罕见甚至是未知的基因变异，在发现药物敏感性突变的同时检测相关的耐药突变(如KRAS和ALK点突变)，准确地反映患者用药后的敏感及耐药信息。

A hybrid capture kit and method for detection of 16 gene hot spots in oncology oncology

The invention discloses a hybrid for individualized tumor 16 genes capture hotspot detection kit, including hybridization reagent and concentration detection reagent, reagent for amplification of PCR; wherein the hybridization reagent comprises the following SEQ NO.1 SEQ NO.396 probe mixture, and the number of moles between each probe was 1:1, detection, concentration of the mixture of 10nM each probe dosage is 1 L. The kit of the invention is to detect the two generation sequencing technology based on gene can detection of 3 types of variation (mutation, deletion, insertion, fusion) with high sequencing depth coverage trace gene mutation, resulting in limited samples under the premise of accurate detection of mutations in patients with, can accurately detect the mutation frequency of 1%. On the one hand, many gene Gao Min perceptual parallel detection to enhance the detection rate of use of genetic variation, do not miss the opportunity to use; on the other hand, can be in a single assay detected hot spots, rare or even unknown gene mutation, the discovery of drug susceptibility mutations associated with mutations in drug resistance (such as KRAS and ALK point mutation), accurately reflect the sensitive and resistant patients after treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法
本专利技术涉及基因突变检测领域，具体涉及为一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其检测方法。
技术介绍
随着肿瘤驱动基因的发现和相应靶向药物的研究和应用，肿瘤治疗已经走上了以基因为导向的个体化治疗之路。靶向治疗作用效率高，毒副作用低，可以更大程度提高肺癌患者的生存质量。然而，靶向治疗药物仅作用于带有特定基因突变的肿瘤细胞，对于不含特定基因突变的肿瘤细胞，靶向药物的疗效甚至不如化疗药物。因此，患者在接受靶向治疗前，必须进行相应的基因检测。肿瘤组织来源的DNA携带有肿瘤细胞独有的基因特征，包括与肿瘤形成和发展有关的基因点突变、插入/缺失、基因融合、拷贝数变异和DNA甲基化异常等，以及肿瘤细胞用药相关的变异。本检测以新鲜血液或唾液等来源的正常细胞为参照样本，以肿瘤新鲜组织或石蜡包埋切片组织等为检测样本，利用靶向捕获技术通过高通量测序同步检测受检者肿瘤组织中16个基因的变异信息。根据检出的点突变、小片段插入/缺失和基因融合变异信息，结合国际相关用药指南分析受检者对相关靶向药物的用药敏感性、耐受性的个体化信息，供受检者参考。本检测方法涉及16个肿瘤靶向药物用药相关的基因，包括ALK、APC、BRAF、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、RB1、RET、ROS1和TP53。检测该16个基因的点突变或单核苷酸多态性、小片段基因插入或缺失以及基因重排信息，详见下表：本检测产品覆盖的靶向药物，详见下表：人类基因组包含30亿碱基对，数据量庞大。即使是采用高通量测序技术，直接对全基因组进行测序也面临着成本高、数据分析复杂、周期长等问题。因此，综合考虑临床目的和经济效益，需要在测序之前先对感兴趣的基因序列进行富集。基因捕获技术作为检测环节中必备的关键技术，是精准医学的基础之一。基因捕获测序的主要优势在于可针对特定区域进行测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，更精确地发现特定区域遗传变异信息。目前常用的基因捕获方法包括杂交捕获和多重PCR扩增。其中，杂交捕获的特点是能够对外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，覆盖度高，均一性高，测序深度高及灵敏度高，同时可匹配极短长度的模板片段或特殊结构的DNA，但操作流程相对多重PCR捕获技术较复杂，有时还需要依赖较多专门的仪器设备；多重PCR则操作简单灵活，模板要求量相对较低，对仪器要求最小化，能在数小时内完成目标序列富集和文库构建，一般仅适用于相对较小50Kb以下的目标序列进行捕获，且对于基因重排如基因融合或倒位、大片段缺失无法检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种可用于高通量、高灵敏度、高稳定性、低成本，主要针对非小细胞肺癌的肿瘤个体化用药基因突变检测的试剂盒。本专利技术主要是利用液相探针杂交捕获技术对靶向用药基因、原癌基因、抑癌基因及细胞信号转导通路上的16个基因热点进行捕获富集，然后通过高通量测序技术对富集后的目标区域进行测序，最终通过生物信息学分析高通量测序数据，从而发现突变情况及其突变频率。本专利技术另一目的是提供一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交富集的方法。本专利技术第一方面的一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，包含SEQNO.1-SEQNO.396探针混合物，且每条探针的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nMeach的上述探针混合物用量为1μl，探针序列如下表：在本专利技术的一个优选实施例中，所述用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括：PCR扩增试剂包括如下SEQNO.397和SEQNO.398构成的引物对：SEQNO.397AATGATACGGCGACCACCGASEQNO.398CAAGCAGAAGACGGCATACGA富集度检测试剂包括如下SEQNO.399-SEQNO.404构成的引物对：SEQNO.399tcaattcattcgatcctcaggtaaccSEQNO.400gatgttctggaaggcaaactccatgSEQNO.401GGCTCGCCAATTAACCCTGATTACSEQNO.402TACCACTGGGCCTCACCTCTATGSEQNO.403GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTSEQNO.404TCATAGGGCACCACCACACTATGT在本专利技术的一个优选实施例中，所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2、HumanCot-1PerfectHybTMPlushybridizationbuffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQNO.405和SEQNO.406构成的引物：SEQNO.405AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTSEQNO.406CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT且摩尔数比为SEQNO.405和SEQNO.406＝1：1，检测时浓度为300μMeach的上述混合液用量为1μl。在本专利技术的一个优选实施例中，所述杂交体系所用试剂由以下体积的各组分组成：在本专利技术的一个优选实施例中，所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的Streptavidinbeads，以及用于洗去非目标DNA的1×washingbuffer、0.1×washingbuffer和将捕获的DNA洗脱下来的FEbuffer。在本专利技术的一个优选实施例中，所述1×washingbuffer缓冲液包括0.15M浓度的氯化钠、15mM的柠檬酸钠和0.1％SDS。在本专利技术的一个优选实施例中，所述0.1×washingbuffer缓冲液包括0.015M的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠、0.1％SDS。在本专利技术的一个优选实施例中，所述FEbuffer缓冲液为pH8.2的含95％甲酰胺的10mMEDTA的溶液。在本专利技术的一个优选实施例中，所述肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒还包括杂交后用于洗涤Streptavidinbeads的BW缓冲液。在本专利技术的一个优选实施例中，BW缓冲液包括5mMTris·Cl、0.5mMEDTA、1.0M氯化钠和0.01％吐温-20。在本专利技术的一个优选实施例中，所述PCR扩增试剂还包括PCR预混液和去离子水。在本专利技术的一个优选实施例中，所述PCR预混液为2×预混液，使用时终浓度为1×。在本专利技术的一个优选实施例中，所述2×预混液包括2×Q5buffer、1×GCenhancerbuffer、各组分浓度为0.4mM的dNTP、用量为0.2μl的浓度2000U/ml为Q5高保真DNA聚合酶。在本专利技术的一个优选实施例中，所述富集度检测试剂还包括2×SYBRGreenMasterMix(vazyme)、Primermix(2uMeach)、dH2O和input/R1/R2。作为本专利技术第二方面的用于肿瘤个体化用药16本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQ NO.1‑SEQ NO.396探针混合物，且每条探针的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl；

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQNO.1-SEQNO.396探针混合物，且每条探针的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nMeach的上述探针混合物用量为1μl；所述PCR扩增试剂包括如下SEQNO.397和SEQNO.398构成的引物对：SEQNO.397AATGATACGGCGACCACCGASEQNO.398CAAGCAGAAGACGGCATACGA富集度检测试剂包括如下SEQNO.399-SEQNO.404构成的引物对：SEQNO.399tcaattcattcgatcctcaggtaaccSEQNO.400gatgttctggaaggcaaactccatgSEQNO.401GGCTCGCCAATTAACCCTGATTACSEQNO.402TACCACTGGGCCTCACCTCTATGSEQNO.403GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTSEQNO.404TCATAGGGCACCACCACACTATGT2.如权利要求1所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交体系所用试剂：Block3.1/3.2、HumanCot-1PerfectHybTMPlushybridizationbuffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQNO.405和SEQNO.406构成的引物：SEQNO.405AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTSEQNO.406CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT且摩尔数比为SEQNO.405：SEQNO.406＝1：1，检测时浓度为300μMeach的上述混合液用量为1μl。3.如权利要求1所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述杂交体系所用试剂由以下体积的各组分组成：4.如权利要求3所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的Streptavidinbeads，以及用于洗去非目标DNA的1×washingbuffer缓冲液、0.1×washingbuffer缓冲液和将捕获的DNA洗脱下来的FEbuffer缓冲液。5.如权利要求4所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述1×washingbuffer缓冲液包括0.15M浓度的氯化钠、15mM的柠檬酸钠和0.1％SDS。6.如权利要求4所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述0.1×washingbuffer缓冲液包括0.015M的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠、0.1％SDS。7.如权利要求4所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述FEbuffer缓冲液为pH8.2的含95％甲酰胺的10mMEDTA的溶液。8.如权利要求4所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，还包括杂交后用于洗涤Streptavidinbeads的BW缓冲液。9.如权利要求8所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，BW缓冲液包括5mMTris·Cl、0.5mMEDTA、1.0M氯化钠和0.01％吐温-20。10.如权利要求1所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂还包括PCR预混液和去离子水。11.如权利要求10所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述PCR预混液为2×预混液，使用时终浓度为1×。12.如权利要求11所述的肿瘤个体化用药16个基因热点检测的...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜婷婷，朱月艳，孙子奎，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31